李俊昊 余天柱 高珊珊 劉霄宇 浦 寧 李長煜 陳 頤 紀 元 樓文暉 王小林

(1上海市影像醫(yī)學研究所 上海 200032; 2復旦大學附屬中山醫(yī)院介入治療科,3普外科,4病理科 上海 200032)

胰腺導管腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一,全世界每年有26萬人死于胰腺癌[1],并且發(fā)病率逐年上升[2]。胰腺癌起病隱匿,通常確診時已經(jīng)發(fā)生轉移[3],加之術后復發(fā)率高、放化療效果不佳[4],故胰腺癌患者預后極差。因此,探索新的胰腺癌治療方式和預后因子對提高胰腺癌的診治水平和改善患者生存期尤為重要。

程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)是程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)的配體,主要表達于免疫細胞和腫瘤細胞。PD-1是活化的T細胞、B細胞、單核細胞以及樹突細胞細胞膜上的跨膜受體[5]。正常組織中,機體可通過PD-L1和PD1調節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。而在癌癥患者體內,腫瘤細胞表面的PD-L1與PD1+CD8+T細胞結合后,活化的T細胞失去免疫功能。癌細胞能夠躲避免疫系統(tǒng)的攻擊,從而發(fā)生免疫逃逸[6]。因此,目前普遍認為PD-L1表達陽性是腫瘤患者預后不良的標志。最近有研究報道,PD-L1表達陽性的腫瘤組織中存在大量腫瘤浸潤淋巴細胞,表現(xiàn)出良好的預后[7]。這似乎提示我們,PD-L1陽性并非只代表腫瘤發(fā)生免疫逃逸,同時也是腫瘤組織內存在大量腫瘤浸潤淋巴細胞的標志。除此之外,臨床上已經(jīng)使用PD1/PDL1抑制劑治療晚期黑色素瘤[8-9]、非小細胞肺癌[10-11]和腎癌[12]等腫瘤,能有效延長腫瘤患者總體生存期。

因此,PD-L1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療密切相關。作為一種新型可預測腫瘤患者預后的因子,PD-L1在判斷胰腺癌預后方面的研究相對較少。本研究旨在探討PD-L1表達與胰腺癌臨床特征之間的關系,以及判斷胰腺癌預后的價值。

資 料 和 方 法

研究對象收集2015年7月至2017年8月復旦大學附屬中山醫(yī)院胰腺外科68例行胰腺癌根治術并進行PD-L1病理染色的患者資料,所有患者術后病理證實為胰腺導管腺癌。將入組患者按照PD-L1染色結果分為PD-L1陽性組和PD-L1陰性組。入組標準:(1)首次行腫瘤根治性切除術;(2)根據(jù)手術病理確診為胰腺導管腺癌;(3)腫瘤組織行PD-L1染色;(4)隨訪和臨床資料完整。排除標準:(1)合并或既往有其他腫瘤病史;(2)胰腺神經(jīng)內分泌腫瘤、腺鱗癌、轉移癌等非胰腺導管腺癌。通過電話、短信、郵件、信件對患者生存時間進行隨訪,隨訪截止到2017年10月24日,結局事件為患者死亡?？偵嫫?overall survival,OS)定義為從行胰腺癌手術開始到隨訪終止日期或患者死亡的時間。

免疫組化染色采用免疫組織化學SP142二步法進行檢測。對腫瘤組織石蠟標本進行連續(xù)切片,厚度4 μm。胰腺癌組織經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇水化后,室溫3%過氧化氫溶液孵育15 min,PBS溶液漂洗3次,每次5 min。后將切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中99 ℃水浴加熱,抗原修復20 min,溫度降至室溫后PBS溶液漂洗,方法同上。5%BSA室溫封閉30 min,兔抗人PD-L1多克隆抗體,4 ℃孵育過夜。次日,PBS漂洗,方法同上,SP142二抗室溫孵育20 min,PBS漂洗,方法同上。DAB顯色劑染色8 min后蒸餾水沖洗,終止顯色。蘇木精復染50 s,自來水沖洗返藍,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

結果判定免疫組化切片均由2名資深病理醫(yī)師雙盲獨立觀察評估,請第3位病理醫(yī)師評估,以兩個相同結果為準。PD-L1以細胞質或細胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。PD-L1表達采用半定量積分法,結合染色強度和陽性細胞百分比來評定陽性表達病例。低倍鏡下觀察5個隨機高倍視野(×400),染色強度分級如下:無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;陽性細胞密度分級為:陽性細胞數(shù)≤10%為1分,10%～50%為2分,>50%為 3分。通過乘積法計算所得結果≥3分為判定為陽性。腫瘤與腫瘤間質中任意一項陽性則認為是PD-L1表達陽性。

統(tǒng)計學分析應用SPSS 22.0軟件對68例患者隨訪數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。通過χ2檢驗分析68例患者PD-L1表達和性別、年齡、原發(fā)部位、腫瘤大小、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結轉移、切緣狀態(tài)及患糖尿病情況等臨床病理特征之間的關系。采用Kaplan-Meier方法分析PD-L1生存曲線,并對曲線進行l(wèi)og-rank檢驗。通過Cox比例風險模型進行單因素和多因素分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義?？紤]到混雜因素影響,且本研究樣本量不大,單因素分析中P<0.1為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

PD-L1表達與胰腺導管腺癌患者臨床基本參數(shù)的關系納入68例患者,年齡40～79歲,其中男性32例,女性36例,分為PD-L1陽性組(51例)和陰性組(17例)。分析兩組患者在性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結轉移、手術方式、手術切緣以及糖尿病患病情況之間的差異。結果顯示,PD-L1表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結轉移、手術方式、手術切緣以及糖尿病等病理特征無關(表1)。

PD-L1表達在可切除胰腺導管腺癌預后判斷中的價值68例患者中死亡12例,失訪6例,生存50例。陽性組平均生存時間(19.4±1.4)個月,陰性組平均生存時間(11.4±0.8)個月。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,log-rank檢驗評估PD-L1在預后判斷OS方面的價值。陽性組生存時間明顯長于陰性組(圖1)。

Cox回歸模型分析影響預后的危險因素采用Kaplan-Meier法對影響術后生存時間的風險因素進行分析,log-rank檢驗結果顯示:PD-L1表達P=0.013、腫瘤大小P=0.013和淋巴結轉移情況P=0.077。將上述3個危險因素納入Cox比例風險模型進行多因素分析發(fā)現(xiàn),PD-L1表達(HR=0.170,95%CI:0.038～0.761,P=0.020)、腫瘤大小(HR=3.542,95%CI:1.121～11.193,P=0.010)與淋巴結轉移情況(HR=5.179,95%CI:1.474～18.195,P=0.019)均為胰腺導管腺癌患者術后生存時間的獨立影響因素(表2)。

表1 PD-L1表達與胰腺導管腺癌患者臨床基本參數(shù)的關系Tab 1 The correlation between clinicopathologic characteristics and PD-L1 expression in patients with resectable pancreatic adenocarcinoma (n=68)

圖1 胰腺導管腺癌患者生存曲線分析Fig 1 Survival curve of patients with resectable pancreatic adenocarcinoma

CharacteristicsMultivariate analysisHR (95%CI)PPD-L1 (positive/negative)0.170 (0.038-0.761)0.020Tumor size (>4 cm/≤4 cm)3.542 (1.121-11.193)0.010Lymph node metastasis (yes/no)5.179 (1.474-18.195)0.019

HR:Hazard ratio.

討 論

我們分析了68例可切除胰腺癌患者PD-L1表達情況與臨床病理特征的關系。在68例胰腺癌患者中,PD-L1陽性患者51例,占總數(shù)的80.9%。χ2檢驗分析結果提示,PD-L1表達情況與臨床病理特征無關。采用Kaplan-Meier法繪制PD-L1生存曲線,PD-L1陽性組患者的生存時間明顯長于PD-L1陰性組患者,log-rank檢驗結果顯示差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013)。采用Kaplan-meier法對影響術后生存時間的風險因素進行分析。結果顯示:PD-L1表達(P=0.013)、腫瘤大小(P=0.013)和淋巴結轉移情況(P=0.077)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.10)。將上述3種危險因素進行多因素分析發(fā)現(xiàn),PD-L1表達情況、腫瘤大小和淋巴結轉移情況均為術后胰腺癌患者OS的獨立影響因素。因此,PD-L1與可切除胰腺癌預后密切相關,這提示我們需要對PD-L1低表達的胰腺導管腺癌患者進行密切的臨床觀察與干預。同時,PD-L1作為一個輔助判斷預后的指標可為臨床醫(yī)師提供更多信息,有利于提高胰腺導管腺癌患者術后的整體生存率。由于本研究納入病例數(shù)目不多,結果不可避免地會存在一些偏倚。在今后研究中我們將積極與其他單位展開合作,通過擴大樣本量和提高研究人員的理論水平進一步完善研究。

近年來,PD-L1表達與腫瘤預后關系的研究主要集中于乳腺癌、肺癌、胃癌、淋巴瘤、直腸癌、腎癌等腫瘤,PD-L1表達與胰腺癌預后關系的研究相對較少。以往,PD-L1表達陽性被認為是腫瘤預后不良的因素,包括非小細胞肺癌、腎癌、黑色素瘤、多形性膠質母細胞瘤、結腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌和卵巢癌[4,13-18]。而最近報道的三陰性乳腺癌與之前研究結果相反,PD-L1表達陽性患者相對PD-L1陰性患者的預后較好,多因素分析證實PD-L1陽性是三陰性乳腺癌OS的獨立影響因素[19]。同樣,結腸直腸癌[20]和黑色素瘤[21]的研究也表明PD-L1陽性患者的預后較好。這些報道與我們的研究結果一致,PD-L1是影響術后胰腺癌患者OS的獨立因素,PD-L1陽性的胰腺導管腺癌患者總體生存時間較長。

胰腺癌PD-L1表達與預后之間的關系目前仍存在爭論。Birnbaum等[22]認為,腫瘤組織PD-L1染色陽性與胰腺癌預后不良有關。我們分析這一相反的結論,可能是不同病理類型胰腺癌PD-L1的表達情況不同造成的。Birnbaum等[22]的研究對象包括胰腺導管腺癌在內的所有病理類型的胰腺癌,而我們的研究對象只納入胰腺導管腺癌患者。其他病理類型胰腺癌與胰腺導管腺癌相比,PD-L1表達情況和預后均有差異,故可能得出相反的結論。此外,有學者認為腫瘤組織表達PD-L1預后較差與腫瘤免疫逃逸有關。既往也有報道指出,腫瘤組織PD-L1表達與腫瘤浸潤淋巴細胞也存在相關性,例如:PD-L1陽性的非小細胞肺癌中存在大量腫瘤浸潤淋巴細胞[23],而PD-L1陽性黑色素瘤出現(xiàn)腫瘤浸潤淋巴細胞的比例高達98%[8]。由于腫瘤浸潤淋巴細胞參與的抗腫瘤炎癥反應是機體的保護機制,因此我們假設:PD-L1陽性胰腺癌患者預后較好,可能與腫瘤浸潤淋巴細胞介導的抗腫瘤炎癥反應有關。這一假設與PD-L1參與腫瘤免疫逃逸的傳統(tǒng)觀點不同,或許可以解釋胰腺導管腺癌PD-L1陽性患者OS長于陰性患者。這一假設正確與否需要進一步的基礎研究加以證實,這是我們今后開展下一步研究的方向。