劉素娟，楊蒙蒙，黃浩，趙世杰，朱慶偉，郭元平，蘇爽月

(牡丹江師范學院 化學化工學院，黑龍江 牡丹江 157011)

1 概述

果酒和果醋有緩解疲勞，促進鈣吸收，預(yù)防高血壓，預(yù)防心臟病和降低血清總膽固醇水平等作用。這些作用主要來源于有機酸、酚類物質(zhì)和醇類物質(zhì)的互相作用。其中酚類物質(zhì)是植物次生代謝物，不僅具有各種生理活性功能，還影響著水果的風味和質(zhì)量品質(zhì)[1-3]。

目前酚類物質(zhì)的分析方法有分光光度法[4]、氣相色譜法[5]和液相色譜法等[6]。4-氨基安替比林分光光度法溶劑使用量大，富集效果差，蒸餾時間長，易造成二次污染[7]；氣相色譜法測定酚類物質(zhì)，需要進行多次液-液萃取和衍生化反應(yīng)，操作過程較為繁瑣[8]；而高效液相色譜(HPLC)法適用于檢測分子量較大、沸點較高、熱穩(wěn)定性差的有機物，彌補了氣相色譜法的不足[9]，可對酚類物質(zhì)進行直接測定，無需進行衍生化反應(yīng)，且分離度好，靈敏度高。因此，本文通過高效液相色譜儀對果酒和果醋中10種酚類物質(zhì)進行分析(對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、咖啡因、香草醛、苯酚、阿魏酸、對硝基苯酚、對氯苯酚、1-萘酚)，本方法操作簡便、快捷，實驗結(jié)果準確、可靠，與同類分析方法相比較在縮短分離時間上具有明顯優(yōu)勢[10-13]。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

2695-2998高效液相色譜儀 美國Waters公司；SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SQP電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；Milli-Q超純水儀 美國密理博公司；酚標準品 Sigma公司；其他試劑均為HPLC級別；實驗用水均為超純水。

2.2 色譜條件

2695-2998高效液相色譜儀(美國Waters公司)。配備2998型二極管陣列檢測器，Empower3色譜工作站。色譜柱為UltimateXB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相A為甲醇-乙酸-水(90∶2∶8)，流動相B為甲醇-乙酸-水(10∶2∶88)，具體流動相梯度見表1，檢測波長為280 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為60 ℃，進樣量為10 μL。在上述色譜條件下，標樣色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of flow phase

2.3 標準溶液的配制

用萬分之一分析天平準確稱取適量10種酚類化合物，分別置于50 mL燒杯中，咖啡因和香草醛用乙醇溶解，其余均用超純水溶解，并用超聲波清洗器輔助溶解，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，均用超純水定容至刻度線，得到標準溶液。使用前稀釋到所需濃度，進樣前均經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

2.4 樣品處理

準確移取10.00 mL超市購買的果酒和果醋于不同的50 mL容量瓶中，加入超純水定容，超聲波清洗器脫氣5 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測波長的確定

用紫外-可見分光光度計對10種酚類物質(zhì)標準溶液從200～400 nm進行掃描，發(fā)現(xiàn)最大紫外吸收波長均在280 nm外，在此波長下測定靈敏度高，峰形好，因此本實驗采用檢測波長為280 nm。

3.2 流動相及梯度洗脫條件的確定

流動相在高效液相色譜法中至關(guān)重要，考察了甲醇-乙酸-水、乙腈-水作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，10種酚類物質(zhì)在甲醇-乙酸-水體系中分離效果較好，通過反復(fù)摸索調(diào)整梯度洗脫程序，峰形和分離度達到要求。流動相A為甲醇-乙酸-水(90∶2∶8)，流動相B為甲醇-乙酸-水(10∶2∶88)，流速為1.0 mL/min，洗脫程序見表1。結(jié)果表明，10種酚類物質(zhì)在25 min之內(nèi)均得到了良好的分離，此條件下標準品的色譜圖見圖1。

圖1 10種酚類標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 10 phenolics standard samples

注：1為對苯二酚，2為間苯二酚，3為鄰苯二酚，4為咖啡因，5為香草醛，6為苯酚，7為阿魏酸，8為對硝基苯酚，9為對氯苯酚，10為1-萘酚。

3.3 流速和柱溫的確定

對流動相的流速和柱溫進行了優(yōu)化選擇。選擇0.8，1.0，1.2 mL/min這3種不同的流速來考察10種酚類物質(zhì)的分離效果。實驗表明，流速為0.8 mL/min時，1-萘酚的保留時間為25.80 min，保留時間較長；流速為1.2 mL/min時，香草醛與苯酚沒有達到基線分離；1.0 mL/min時，1-萘酚的保留時間為24.275 min，香草醛與苯酚的分離度較大。綜合考慮保留時間和分離效果，最終選擇1.0 mL/min。

柱溫影響保留時間、柱效、選擇性等。當溫度升高時，分析時間縮短，儀器壓強降低；溫度較低時，儀器壓強升高，保留時間延長。控制流速均為1.0 mL/min，在35，40，45，50，55，60 ℃下進行實驗，探究色譜柱溫度對10種酚類物質(zhì)分離度的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，10種酚類物質(zhì)的保留時間逐漸縮短。柱溫從35 ℃改變至60 ℃時，10種酚類物質(zhì)的保留時間從26.50 min縮短至24.275 min。色譜柱的最大承受溫度為65 ℃，綜合實驗結(jié)果，選擇60 ℃為最佳實驗溫度。

3.4 標準曲線及檢出限

將10種酚類物質(zhì)的標準混合溶液逐步稀釋，配制成濃度分別為400，200，100，50，10 mg/L的混合標準溶液，在最佳色譜條件下進行檢測，根據(jù)實驗結(jié)果，繪制10種酚類物質(zhì)的標準曲線，得出線性方程及相關(guān)系數(shù)，實驗結(jié)果見表2。

表2 線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients

由表2可知，10種酚類物質(zhì)的線性關(guān)系良好，并且檢出限較低，說明方法靈敏度較高。

3.5 回收率及精密度的測定

在實驗確定的最佳色譜條件下，選取1#果酒樣品，分別加入10，50，100 mg/L標準混合溶液，平行進行6次實驗，實驗結(jié)果見表3?；厥章蕿?1.6%～102.8%，相對平均偏差不大于4.4%，說明方法精密度高，準確度好。

表3 回收率及精密度Table 3 Recoveries and precision

續(xù) 表

3.6 實際樣品的測定

本實驗購買了超市銷售的果酒和果醋。在最佳色譜條件下對多種果酒和果醋進行了檢測，檢測結(jié)果見表4，典型代表色譜圖見圖2。

表4 樣品中酚類物質(zhì)的含量Table 4 The content of phenolics in samples mg/L

注：“-”表示未檢出。

圖2 1#果酒色譜圖Fig.2 Chromatogram of 1# fruit wine

注：1為對苯二酚，2為間苯二酚，3為鄰苯二酚，4為苯酚。

結(jié)果表明，果酒主要含有的酚類物質(zhì)為對苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚、苯酚。其中僅3#果酒含有咖啡因；2#果酒不含間苯二酚、鄰苯二酚和咖啡因；5#葡萄酒只含咖啡因，4#果醋只含有間苯二酚。

4 結(jié)論

采用高效液相色譜-二極管陣列聯(lián)用技術(shù)對10種酚類物質(zhì)進行分離與測定，在實驗確定的最佳條件下，10種酚類物質(zhì)在25min內(nèi)達到完全基線分離。本方法檢測速度快，精密度高，可靠性好，操作步驟簡單，樣品處理方法簡單，對于果醋、果酒的檢測很有實用價值。