王慧琳， 周煒城， 任 聰,3， 徐 巖,2,3

(1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 釀酒微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室， 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué) 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 無(wú)錫 214122)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品技藝是一類用于食品保存和食品風(fēng)味增強(qiáng)的食品加工技術(shù),其歷史久遠(yuǎn)。傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)多采用自然接種，生產(chǎn)過(guò)程中涉及的微生物種類繁多，在分子微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)出現(xiàn)之前，人們嚴(yán)重低估了傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物種類及其代謝產(chǎn)物多樣性。近年來(lái)，研究者使用基于16s rRNA/ITS的擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，不斷解析發(fā)酵食品生產(chǎn)過(guò)程中微生物菌群的群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[1]；使用宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，揭示發(fā)酵過(guò)程的核心功能微生物[2]以及微生物互作機(jī)理[3]。

1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組的基本特征

人們對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組的認(rèn)識(shí)過(guò)程是一個(gè)由解析微生物結(jié)構(gòu)到逐漸明晰微生物功能的過(guò)程，并逐漸總結(jié)出傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組具有微生物種類繁多、功能多樣、微生物之間相互作用復(fù)雜的基本特征。在此基礎(chǔ)上，深入認(rèn)識(shí)復(fù)雜的傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組還需要闡明眾多參與發(fā)酵微生物中的核心功能微生物，建立微生物種類與功能的聯(lián)系以及微生物相互作用與發(fā)酵進(jìn)程的聯(lián)系。

1.1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品制造過(guò)程中的微生物種類與功能

傳統(tǒng)發(fā)酵食品多通過(guò)自然接種或輔以微生物強(qiáng)化的自然接種，發(fā)酵過(guò)程由多種微生物共同作用完成。過(guò)去主要通過(guò)傳統(tǒng)的可培養(yǎng)手段認(rèn)識(shí)微生物，該方法具有較大的局限性，耗時(shí)費(fèi)力且只能檢測(cè)到有限的微生物種類，不能反映發(fā)酵體系真實(shí)的微生物組成。而近十年來(lái)，隨著PCR-DGGE技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)的廣泛使用，人們對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品制造過(guò)程中微生物種類和微生物演替的認(rèn)識(shí)發(fā)生了質(zhì)的飛躍(表1)。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的重要功能之一是產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)，這類產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的功能微生物賦予傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味多元的特點(diǎn)。過(guò)去的研究往往集中于解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵過(guò)程的微生物組成結(jié)構(gòu)，或探究傳統(tǒng)發(fā)酵食品中風(fēng)味物質(zhì)的種類，而缺少對(duì)產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)功能微生物的系統(tǒng)研究。近年來(lái)，將高通量測(cè)序技術(shù)與多元統(tǒng)計(jì)的分析方法相結(jié)合，已有越來(lái)越多的研究將微生物與傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味真正地聯(lián)系起來(lái)。微生物與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析將有助于鑒定發(fā)酵食品體系中的核心功能微生物。Wang等通過(guò)使用O2PLS(Bidirectional orthogonal partial least squares，雙向正交偏最小二乘法：將不同分析平臺(tái)產(chǎn)生數(shù)據(jù)集進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析用來(lái)揭示數(shù)據(jù)間的潛在關(guān)系)方法，將食醋發(fā)酵0～18 d微生物群落結(jié)構(gòu)與風(fēng)味化合物的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，鑒定出7個(gè)屬的細(xì)菌為核心功能微生物，揭示細(xì)菌而非真菌，是食醋風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者[4]。

目前在傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域，將不同組學(xué)平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析的報(bào)道還較少。隨著測(cè)序成本的逐漸降低和測(cè)序精度的不斷提升，大量、精確數(shù)據(jù)的獲得將不再成為限制研究的門檻。研究者更多需要解決的問(wèn)題是，如何根據(jù)生物學(xué)問(wèn)題對(duì)海量的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入而有效分析，以完全剖析釀造體系中微生物的種類與功能，如近年來(lái)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在傳統(tǒng)釀造的產(chǎn)風(fēng)味微生物解析中發(fā)揮了巨大的作用。通過(guò)將微生物與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)聯(lián)，還有利于規(guī)避憑借微生物相對(duì)豐度高低判定其在發(fā)酵過(guò)程中重要性大小的錯(cuò)誤。過(guò)去的研究認(rèn)為，芽孢桿菌屬與腸球菌屬的微生物是韓國(guó)大醬主要的發(fā)酵微生物，但是Jung等通過(guò)研究大醬發(fā)酵全過(guò)程的微生物組成以及代謝物變化，發(fā)現(xiàn)雖然芽孢桿菌屬與腸球菌屬的微生物是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)微生物，但是其豐度變化與代謝產(chǎn)物變化不具有一致性。研究者發(fā)現(xiàn)，伴隨著四聯(lián)球菌屬微生物豐度的上升，發(fā)酵體系中葡萄糖、果糖快速消耗，乳酸、乙酸等風(fēng)味物質(zhì)大量產(chǎn)生；伴隨著乳酸菌屬微生物豐度的上升，發(fā)酵體系中γ-氨基丁酸含量上升，故實(shí)際參與大醬發(fā)酵的功能微生物是四聯(lián)球菌屬與乳酸菌屬的微生物[5]。

擴(kuò)增子測(cè)序多用于分析微生物菌群的組成結(jié)構(gòu)，而對(duì)于微生物代謝功能的研究，則需要借助宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)。宏基因組學(xué)技術(shù)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物菌群功能方面各有所長(zhǎng)，宏基因組學(xué)能對(duì)發(fā)酵體系中的微生物暗物質(zhì)[6](未培養(yǎng)微生物)潛在代謝功能進(jìn)行研究，如對(duì)大曲和窖泥中的未培養(yǎng)微生物進(jìn)行研究，還可以鑒定發(fā)酵體系中的核心微生物及其潛在代謝特征。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)則可以區(qū)分出代謝活躍的微生物及其活躍的代謝途徑。Jung等分析韓國(guó)泡菜發(fā)酵過(guò)程中微生物的全局基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)泡菜不同發(fā)酵階段由不同微生物主導(dǎo)：明串珠菌屬微生物L(fēng)c.Mesenteroides是發(fā)酵前期的活躍微生物，而魏斯氏菌屬微生物W.koreensis以及清酒乳桿菌(Lb.sakei)是發(fā)酵后期的活躍微生物[7]。宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合對(duì)發(fā)酵進(jìn)程的跟蹤，還可以進(jìn)一步闡明不同發(fā)酵階段的主要功能微生物及其在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮的作用。宋哲瑋等通過(guò)對(duì)醬香型白酒發(fā)酵體系酵母(Pichia：畢赤酵母屬，Schizosaccharomyces：裂殖酵母屬，Saccharomyces：酵母屬，Zygosaccharomyces：接合酵母屬)，以及乳酸菌屬微生物的丙酮酸代謝途徑進(jìn)行分析，揭示核心功能微生物裂殖酵母屬與乳酸菌屬微生物在發(fā)酵的不同階段進(jìn)行功能轉(zhuǎn)換，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)了發(fā)酵過(guò)程由產(chǎn)生醇類(乙醇)至產(chǎn)生酸類(乳酸)的轉(zhuǎn)變[2]。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用使我們對(duì)發(fā)酵體系的了解不僅局限于微生物的種類與豐度，還擴(kuò)展到微生物的功能與互作關(guān)系，從而對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵過(guò)程的認(rèn)識(shí)實(shí)現(xiàn)了從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)的轉(zhuǎn)變。但由于傳統(tǒng)發(fā)酵食品基質(zhì)復(fù)雜，提取完整的RNA極具挑戰(zhàn)，這限制了宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。除宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)外，宏蛋白組學(xué)[8]也逐漸應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物菌群的功能研究，但該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)在于目前尚缺少針對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品體系微生物的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，尤其是對(duì)于未培養(yǎng)微生物的蛋白質(zhì)難以進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定?？傮w而言，綜合應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)，結(jié)合可靠的統(tǒng)計(jì)分析方法仍然是闡明傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落功能的有力手段。

1.2 微生物相互作用在傳統(tǒng)發(fā)酵食品制造中的重要作用

傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作過(guò)程中，多種微生物相互作用(協(xié)同、競(jìng)爭(zhēng)、共生等)，在同一發(fā)酵體系中，微生物群落發(fā)生有序演替。解析傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物的相互作用，將有助于：1)深入理解群落演替規(guī)律，解析發(fā)酵機(jī)理；2)探明風(fēng)味物質(zhì)來(lái)源；3)通過(guò)微生物相互作用，抑制有害微生物的生長(zhǎng)或有害代謝物的產(chǎn)生，保障傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全性。

微生物種群演替究竟是由環(huán)境條件改變引起，還是由微生物相互作用引起，抑或是二者綜合作用的結(jié)果？Kastman等從環(huán)境因素與生物因素兩個(gè)角度，對(duì)奶酪皮上葡萄球菌屬微生物生態(tài)分布規(guī)律進(jìn)行研究，為解決這一問(wèn)題提供了可參考的方法。研究人員發(fā)現(xiàn)較晚定殖在奶酪皮上并最終成為奶酪皮上優(yōu)勢(shì)菌株的馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)在體外培養(yǎng)時(shí)卻具有最弱的競(jìng)爭(zhēng)力。為解釋這一矛盾的現(xiàn)象，研究人員首先分別對(duì)3種葡萄球菌的生態(tài)位進(jìn)行調(diào)查，而后用共培養(yǎng)方法驗(yàn)證了在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著相關(guān)性的葡萄球菌與霉菌的相互作用關(guān)系，最終確定是帚霉(Scopulariopsis)促進(jìn)馬胃葡萄球菌的生長(zhǎng)。通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組分析揭示，這種促進(jìn)作用可能是通過(guò)帚霉產(chǎn)生的鐵載體蛋白，從而減輕馬胃葡萄球菌自身合成鐵載體的負(fù)擔(dān)或直接為馬胃葡萄球菌提供鐵源促進(jìn)其生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)的。該項(xiàng)研究結(jié)果表明，奶酪皮上的葡萄球菌屬微生物的演替主要由生物因素驅(qū)動(dòng)，在生產(chǎn)上，可以通過(guò)強(qiáng)化特定霉菌促進(jìn)有益葡萄球菌生長(zhǎng)，從而抑制奶酪生產(chǎn)中潛在病原菌的繁殖[3]。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組成與功能研究進(jìn)展

傳統(tǒng)發(fā)酵食品具有的獨(dú)特風(fēng)味是其深受消費(fèi)者喜愛(ài)的重要原因，純培養(yǎng)菌株的生理代謝特征研究不足以解釋傳統(tǒng)發(fā)酵食品中所有風(fēng)味物質(zhì)的來(lái)源，微生物相互作用可以增加風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量或合成單一微生物難以合成的風(fēng)味化合物。以白酒為例，酵母菌與乳酸菌是涉及白酒硫化物代謝的核心微生物，乳酸菌可以為酵母菌提供合成3-甲硫基-1-丙醇和二甲基二硫的前體物質(zhì)甲硫氨酸，相比單培養(yǎng)，酵母菌與乳酸菌之間的協(xié)同作用極大地提高了酵母菌產(chǎn)3-甲硫基-1-丙醇和二甲基二硫的能力，增強(qiáng)了白酒的風(fēng)味[32]。

除了增強(qiáng)有益風(fēng)味，設(shè)法減少傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的異嗅物質(zhì)、抑制有害物質(zhì)生成也是人們一直以來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)。出于食品安全的角度，可以利用微生物相互作用，抑制產(chǎn)異嗅物質(zhì)或有害物質(zhì)的微生物，來(lái)達(dá)到優(yōu)化傳統(tǒng)發(fā)酵食品品質(zhì)的目的。鏈霉菌產(chǎn)生的土味素是清香型白酒中的典型異嗅物質(zhì)，采用芽孢桿菌(Bacillussubtilis2-16 以及Bacillusamyloliquefaciens1-45)能夠有效抑制土味素產(chǎn)生菌株Streptomycessampsonii的生長(zhǎng)，將這兩株芽孢桿菌添加至發(fā)酵體系中，土味素的去除率分別可達(dá)45%與15%[33-34]。由此可見(jiàn)，不斷加深對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物相互作用關(guān)系的認(rèn)識(shí)，有助于從發(fā)酵源頭增強(qiáng)風(fēng)味物質(zhì)生成或控制不良風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。

2 傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物資源

國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多研究致力于分離傳統(tǒng)發(fā)酵食品中具有抗菌、益生等功能的菌株(表2)。

一些分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品的菌株在其他生物技術(shù)領(lǐng)域也具有較好的應(yīng)用價(jià)值。例如，從納豆中分離出的Bacillussubtilisnatto CCT7712菌株產(chǎn)生的果聚糖蔗糖酶可用于生產(chǎn)低聚果糖與果聚糖[35]；從窖泥中分離出的ClostridiumkluyveriN6具有高效利用乙醇生產(chǎn)高值化學(xué)品己酸的能力[36]；從窖泥中分離出的ClostridiumBEY8，Ruminococcaceaebacterium CPB6具有轉(zhuǎn)化廢水中乳酸生產(chǎn)丁酸、己酸的能力[37-38]；從高溫大曲中分離得到的BacillusamyloliquefaciensMT45與X82共培養(yǎng)可以發(fā)酵廢酒糟生產(chǎn)表面活性劑[39]。

表2 從傳統(tǒng)發(fā)酵食品體系中分離到的功能菌株

3 傳統(tǒng)發(fā)酵食品的質(zhì)量監(jiān)控及品質(zhì)優(yōu)化

傳統(tǒng)食品從原料到最終產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化主要由發(fā)酵過(guò)程中的微生物驅(qū)動(dòng)，生產(chǎn)多采用開(kāi)放式接種方式、發(fā)酵過(guò)程較長(zhǎng)，因此，及時(shí)、準(zhǔn)確的監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程對(duì)于保障傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全與品質(zhì)顯得尤為重要。

3.1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品全過(guò)程的微生物監(jiān)控

自然接種的發(fā)酵食品微生物來(lái)源廣泛，生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)工具以及操作過(guò)程帶入的微生物可能共同參與了發(fā)酵過(guò)程。為了保證發(fā)酵的正常進(jìn)行，就需要明晰參與發(fā)酵的微生物的主要來(lái)源以及對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的監(jiān)控。

生產(chǎn)場(chǎng)所小環(huán)境是發(fā)酵食品微生物的主要來(lái)源之一。Bokulich等研究奶酪與清酒生產(chǎn)相關(guān)微生物時(shí)均發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵基質(zhì)中主要的發(fā)酵微生物主要來(lái)源于生產(chǎn)環(huán)境[46-47]，王雪山等也揭示在清香型白酒釀造過(guò)程中，環(huán)境微生物群落是發(fā)酵微生物的重要來(lái)源，并且驅(qū)動(dòng)了白酒發(fā)酵過(guò)程的微生物演替以及代謝特征改變[48]。

3.2 傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全性保障與品質(zhì)優(yōu)化

傳統(tǒng)發(fā)酵食品采用自然接種的方式進(jìn)行生產(chǎn)，在生產(chǎn)過(guò)程中容易受到外源雜菌的污染。

目前，已有較多利用微生物方法來(lái)控制發(fā)酵食品中有害物質(zhì)生成的例證。傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，如豆醬、醬油等在制曲過(guò)程中難免會(huì)受到黃曲霉毒素的污染(發(fā)酵過(guò)程污染雜菌或通過(guò)原料帶入)，Li等從醬油醪中篩選得到一株耐高鹽酵母CandidaversatilisCGMCC 3790，該酵母可以通過(guò)生物降解途徑有效去除黃曲霉毒素，在實(shí)際體系中黃曲霉毒素去除率超過(guò)41.24%[49]。氨基甲酸乙酯(EC，Ethyl carbamate)是醬油、葡萄酒、黃酒、白酒等國(guó)內(nèi)外發(fā)酵食品中普遍存在的一種具有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)[50]，控制發(fā)酵食品中EC含量的方法包括控制EC合成前體(尿素、精氨酸)或直接利用EC降解微生物將EC進(jìn)行降解。杜海等研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有與酵母競(jìng)爭(zhēng)利用精氨酸的能力以及降解尿素的能力；一些非常規(guī)酵母(畢赤酵母、裂殖酵母、接合酵母)與釀酒酵母相比，合成尿素能力更弱，且降解尿素的效率更高[51]。這些研究結(jié)果指導(dǎo)我們?cè)诎拙乒虘B(tài)發(fā)酵中，可以使用乳酸菌與非常規(guī)酵母來(lái)控制EC的產(chǎn)生。崔凱翔等利用生物降解的方式在自然發(fā)酵體系中減少EC含量，LysinibacillussphaericusMT33菌株對(duì)于EC以及尿素的降解具有良好的作用，實(shí)驗(yàn)室條件下將該菌株接種至白酒液態(tài)發(fā)酵體系，發(fā)酵終點(diǎn)體系中EC和尿素含量分別下降41.77%和28.15%，成品酒中EC的濃度下降了63.32%[52]。以上的研究結(jié)果表明，利用微生物自身代謝特點(diǎn)對(duì)發(fā)酵食品中有害物質(zhì)進(jìn)行控制是一種安全且行之有效的方法。

4 展望

一般而言，部分傳統(tǒng)發(fā)酵食品優(yōu)質(zhì)品率較低，對(duì)其生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行現(xiàn)代化改造是保證傳統(tǒng)發(fā)酵食品質(zhì)量更優(yōu)、生產(chǎn)效率更高的關(guān)鍵。但是如何在實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、提高生產(chǎn)效率的同時(shí)，不改變發(fā)酵食品本身豐富的風(fēng)味一直是困擾人們的難題。日本醬油使用多菌種純種微生物混合發(fā)酵進(jìn)行釀造，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化成功的典型例證。同樣是混合發(fā)酵，我國(guó)麩曲白酒的品質(zhì)明顯不及大曲白酒?？梢?jiàn)，對(duì)于不同的傳統(tǒng)發(fā)酵食品而言，一味地對(duì)發(fā)酵菌種進(jìn)行精簡(jiǎn)，并非完美的解決方案。

人為配比添加的復(fù)合菌種發(fā)酵食品往往無(wú)法達(dá)到自然接種發(fā)酵食品的品質(zhì)，這也是其他具有復(fù)雜微生物組成的傳統(tǒng)發(fā)酵食品面臨的問(wèn)題。解決這一問(wèn)題就需要我們繼續(xù)深入對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組進(jìn)行審視：1)綜合運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物的基因多樣性、代謝特征多樣性進(jìn)行全面探查，并建立成熟的傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物組分析方法。2)更加注重生物因素對(duì)發(fā)酵食品微生物菌群組裝、演替的影響。只有加深對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物相互作用的認(rèn)識(shí)，才能科學(xué)的添加/強(qiáng)化特定微生物，減輕異嗅物質(zhì)對(duì)發(fā)酵食品風(fēng)味的影響、增強(qiáng)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的營(yíng)養(yǎng)保健功能。3)建立適合于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的可培養(yǎng)技術(shù)手段。發(fā)酵食品體系特殊的環(huán)境條件馴化出較自然生境中性狀更為優(yōu)良的菌株，但是由于目前可培養(yǎng)技術(shù)的局限，許多潛在功能菌株還不能實(shí)現(xiàn)分離培養(yǎng)，應(yīng)用新的技術(shù)手段已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)海洋、土壤、腸道中許多不可培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)這些技術(shù)的學(xué)習(xí)借鑒，有助于深入挖掘傳統(tǒng)發(fā)酵食品的菌種資源。