趙真真, 鄭訓(xùn)梅, 葉子園, 戴婧, 陳方新, 梅玉云

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院， 合肥 230036)

玉米是世界上重要的糧食作物。除食用外，玉米還是畜牧業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的重要原料。隨著耕作制度的調(diào)整、氣候條件的變化、玉米品種的更新及種植面積的不斷提高，玉米在生長(zhǎng)過(guò)程中特別是生長(zhǎng)的中后期經(jīng)常受到多種病原微生物的侵染和危害，從而造成玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[1-3]。玉米小斑病(Corn southern leaf light)是世界各國(guó)玉米種植區(qū)危害較頻繁的重要葉部病害之一，感病品種在一般發(fā)病年份可造成減產(chǎn)10%～20%，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致玉米葉片提前枯死，產(chǎn)量損失可達(dá)30%以上，甚至顆粒無(wú)收[4-7]。在中國(guó)，玉米小斑病發(fā)生較為普遍和嚴(yán)重的區(qū)域主要分布在黃河及長(zhǎng)江流域的溫暖、潮濕地區(qū)，特別是在黃淮海夏玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)病相對(duì)較重。夏玉米小斑病發(fā)生和流行受諸多因素影響，包括易感病生育期的氣候條件、田間小環(huán)境、播種時(shí)間、播種密度和玉米品種抗病性等。眾多研究表明，小斑病發(fā)生和流行的時(shí)間主要集中在7月中旬玉米進(jìn)入生長(zhǎng)中后期，此時(shí)，月平均氣溫在25℃以上、雨水多時(shí)易導(dǎo)致小斑病流行[8-12]。

玉米是安徽省重要的糧食作物和飼料作物。近年來(lái)，鮮食糯玉米和甜玉米在安徽省局部地區(qū)也有較快發(fā)展。隨著玉米品種、種植面積和種植范圍的不斷擴(kuò)大，其總產(chǎn)量也穩(wěn)步提升。玉米南方銹病、彎孢霉葉斑病、大斑病、小斑病等葉部病害的危害也呈擴(kuò)大和上升趨勢(shì)。小斑病是安徽省玉米生長(zhǎng)過(guò)程中的常發(fā)病害，在安徽淮北夏玉米主產(chǎn)區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重[13-14]。小斑病在玉米各個(gè)生育階段均可造成危害，抽雄后和灌漿期發(fā)病更為嚴(yán)重，主要危害玉米葉片，降低光合作用的有效面積，影響同化產(chǎn)物的積累[15]。該病的病原為玉蜀黍平臍蠕孢菌(Bipolarismaydis)，屬無(wú)性態(tài)真菌(Anamorphic fungi)中的絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomycetales)、平臍蠕孢屬(Bipolaris)真菌。小斑病菌是一種典型的非專(zhuān)性寄生菌，主要以菌絲體和無(wú)性態(tài)孢子的形式在玉米殘?bào)w上度過(guò)逆境，其主要初侵染源是上個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)收獲后留下的病株殘?bào)w。本研究在安徽省玉米小斑病發(fā)生盛期，廣泛采集田間病葉，通過(guò)組織分離法和單孢分離法分離獲得小斑病菌菌株30株，研究了30個(gè)菌株的菌落特點(diǎn)、菌絲生長(zhǎng)速率、分生孢子產(chǎn)生能力等生物學(xué)特性，旨在對(duì)下一步研究安徽省不同地理區(qū)域的小斑病菌菌株的致病性分化、抗藥性及遺傳多樣性提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 玉米小斑病病葉的采集

2016年8月，在安徽省玉米小斑病發(fā)生期采集具有典型癥狀的病葉，并裝于牛皮紙袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，采集地主要在安徽省合肥、滁州、阜陽(yáng)、六安、宿州、蚌埠、淮北和亳州8個(gè)地點(diǎn)[18]。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[16]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1000 mL，自然pH值。

WA培養(yǎng)基[16]：瓊脂20 g，水1000 mL，自然pH值。

1.3 玉米小斑病菌的分離、純化與鑒定

采用組織分離法和單孢分離法[16]。將具有典型癥狀的小斑病病葉沿病健交界處剪成4 mm見(jiàn)方的正方形小塊。依次用0.1%的升汞溶液表面消毒2 min、75%的酒精浸泡30 s后，再用無(wú)菌水沖洗4次。將消毒后的病葉放在PDA平板上，每個(gè)平板放4塊，將培養(yǎng)皿倒置放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待病葉邊緣長(zhǎng)出菌絲后，用挑針挑取菌落前沿的菌絲塊轉(zhuǎn)接到PDA平板上，并通過(guò)單孢分離法進(jìn)一步純化。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地及無(wú)性孢子的形態(tài)特征對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定后備用。

1.4 玉米小斑病菌的生物學(xué)特性研究

1.4.1 玉米小斑病菌菌絲生長(zhǎng)速率的測(cè)定

將鑒定后的30株小斑病菌轉(zhuǎn)接到PDA平板上活化4 d后，沿菌落邊緣制取菌餅(半徑3 mm)，將菌餅轉(zhuǎn)接到PDA平板中央，每個(gè)菌株重復(fù)4次。將上述各處理放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天，逐日測(cè)量并記載菌落直徑，直至菌絲滿(mǎn)皿[20-23]。

菌落凈生長(zhǎng)直徑(cm)=菌落測(cè)量直徑- 菌餅直徑

1.4.2 玉米小斑病菌分生孢子產(chǎn)生量的測(cè)定

將方法1.4.1中培養(yǎng)10 d的小斑病菌菌株，在相同位置用打孔器制取4個(gè)菌餅后，裝入含有1.5 mL 0.05%吐溫-80水溶液的離心管中，并在渦旋振蕩器上充分振蕩2 min，使分生孢子均勻分散在溶液中。采用血球計(jì)數(shù)板觀察400個(gè)小格的分生孢子數(shù)。每個(gè)處理4次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)平均產(chǎn)孢量。數(shù)據(jù)處理采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件[24]。

1.4.3 玉米小斑病菌菌落特征、分生孢子形態(tài)觀察及分生孢子大小測(cè)定

將小斑病菌在PDA平板上培養(yǎng)8 d后，觀察并記載各個(gè)菌株的菌落特征。用0.05%吐溫-80水溶液洗下供試菌株的分生孢子，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)和顏色，并用測(cè)微尺測(cè)量分生孢子大小。以30個(gè)分生孢子的平均值作為分生孢子大小。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件，Duncan新復(fù)極差法處理，在0.05水平上分別分析差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米小斑病菌的分離

通過(guò)組織分離法和單孢分離法從蚌埠、合肥、六安等8個(gè)玉米產(chǎn)區(qū)分離獲得30個(gè)菌株，結(jié)合菌落形態(tài)、菌落顏色、菌落質(zhì)地、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形態(tài)等特性鑒定30個(gè)菌株均為玉米小斑病菌，菌株編號(hào)及具體采集地點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 玉米小斑病菌菌株編號(hào)及采集地

2.2 玉米小斑病菌的菌絲生長(zhǎng)速率

方差分析結(jié)果(表2)顯示，分離自安徽省8個(gè)地區(qū)的30個(gè)菌株在菌絲生長(zhǎng)速率上存在顯著差異。30個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)速率范圍為0.40～1.33 cm/d。其中，F(xiàn)Y1菌株的菌絲生長(zhǎng)速率最大，生長(zhǎng)速率為1.33 cm/d； 其次是FY2菌株；BB2菌株的生長(zhǎng)速率最小，為0.40 cm/d。FY1菌株與BB2菌株的菌絲生長(zhǎng)速率相差最大達(dá)0.93 cm/d。

2.3 玉米小斑病菌的分生孢子產(chǎn)生量

通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的方法比較了30個(gè)菌株在分生孢子產(chǎn)生量上的差異。結(jié)果顯示，30個(gè)菌株的產(chǎn)孢量存在顯著差異。產(chǎn)孢量最大的菌株是BB7，培養(yǎng)至第10天時(shí)其產(chǎn)孢量為25.02×104個(gè)/mL；其次是HB1菌株，產(chǎn)孢量是16.53×104個(gè)/mL；菌株BB3的產(chǎn)孢量相對(duì)較低，僅有0.75×104個(gè)/mL；在分離得到的30個(gè)菌株中，產(chǎn)孢量最低的菌株是BB2，培養(yǎng)至第10天時(shí)仍未見(jiàn)其產(chǎn)孢(見(jiàn)表3)。結(jié)合30個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)速率(表2)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)孢量和菌落生長(zhǎng)速率沒(méi)有必然的聯(lián)系。

表2 玉米小斑病菌不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速率

2.4 玉米小斑病菌不同菌株的菌落特點(diǎn)和分生孢子大小觀察

2.4.1 玉米小斑病菌菌落形態(tài)觀察

將30個(gè)菌株分別轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)8 d后，分別觀察并記載各個(gè)菌株的菌落顏色、形態(tài)和質(zhì)地。發(fā)現(xiàn)不同菌株間在菌絲生長(zhǎng)快慢和菌落顏色上存在較大的差異，特別是菌株CZ3、CZ1、HF2和BB7(圖1)。菌株CZ3和CZ1分離自滁州市，其菌絲生長(zhǎng)速率較快，菌落較大，質(zhì)地疏松，顏色為灰白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)。HF2菌株分離自合肥市，菌落顏色較其他菌株深，菌落顏色呈黑色，質(zhì)地緊密，菌落厚且隆起。BB7菌株分離自蚌埠市，菌落生長(zhǎng)緩慢，菌落上呈現(xiàn)白色發(fā)達(dá)的氣生菌絲，黑色的生殖菌絲少而稀疏。

圖1 玉米小斑病菌不同菌株的菌落顏色及形態(tài)圖

2.4.2 玉米小斑病菌分生孢子的大小比較

通過(guò)測(cè)微尺測(cè)量了相同培養(yǎng)條件下小斑病菌30個(gè)菌株的分生孢子長(zhǎng)度和寬度，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果顯示30個(gè)菌株的分生孢子大小存在顯著性差異(圖2、表4和表5)，8個(gè)不同地區(qū)分離的菌株在分生孢子大小上沒(méi)有明顯的規(guī)律性。由表4可以看出，在測(cè)量的30個(gè)菌株中，F(xiàn)Y1菌株的分生孢子長(zhǎng)度最大，30個(gè)分生孢子的平均長(zhǎng)度為85.91 μm，最小的為BB2菌株，30個(gè)分生孢子的長(zhǎng)度為38.78 μm。由表5可以看出，在供試的30個(gè)菌株中，分生孢子寬度最大的為FY3菌株，其分生孢子寬度為18.65 μm，最小的為BB1菌株，其分生孢子寬度為9.57 μm。

圖2 玉米小斑病菌分生孢子形態(tài)

菌株號(hào)Number分生孢子長(zhǎng)度(μm)Conidia length差異顯著性(0.05)Differene significance菌株號(hào)Number分生孢子長(zhǎng)度(μm)Conidia length差異顯著性(0.05)Differene significanceFY185.91±0.28aCZ264.21±0.19defgBB684.36±0.23aSZ262.95±0.23efgFY383.27±0.19aLA362.12±0.16fghHB181.05±0.22abHB361.33±0.21fghiHF379.38±0.26abcCZ360.12±0.29fghiBB475.83±0.17bcdBZ360.01±0.11fghiLA175.21±0.20bcdCZ159.85±0.13fghiFY273.78±0.16cdeBZ158.32±0.24ghiLA273.12±0.24cdeHF257.11±0.18hijBZ172.24±0.18cdeSZ356.25±0.27hijkBB771.11±0.21cdeHF154.38±0.17ijkSZ170.94±0.15cdeBB153.03±0.20jkBB568.24±0.17deBZ252.11±0.16klHB266.22±0.25defBB350.22±0.25lBZ465.14±0.27defgBB238.78±0.27m

3 討論與結(jié)論

玉米小斑病是玉米生長(zhǎng)過(guò)程中常發(fā)的重要葉部病害，病重年份嚴(yán)重制約著玉米產(chǎn)量和品質(zhì)?？蒲泄ぷ髡邔?duì)小斑病菌的致病性分化、生理小種的類(lèi)型及鑒定、毒素的種類(lèi)及致病機(jī)理、抗病品種的培育、遺傳多樣性等方面做了大量工作[17-20]。但中國(guó)地域遼闊，各個(gè)地區(qū)的氣候條件、耕作習(xí)慣、種植水平及品種類(lèi)型存在極大差異，病原菌的生物學(xué)特性、致病性和寄主的抗病性處于長(zhǎng)期的共同進(jìn)化中。在此過(guò)程中，環(huán)境的變化、品種的更替、管理水平的變化均可造成病原菌寄生適合度發(fā)生改變，這些改變可通過(guò)病原菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的快慢，繁殖體的產(chǎn)生量和菌株致病性等方面的變化表現(xiàn)出來(lái)。謝紅輝[21]和代玉立等[22]研究了培養(yǎng)基的酸堿度、培養(yǎng)溫度、營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)小斑病菌菌絲生長(zhǎng)及分生孢子產(chǎn)生量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)不同地區(qū)玉米小斑病菌的生長(zhǎng)影響不大，但最適酸堿度、營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)孢量的影響較大。

表5 玉米小斑病菌分生孢子寬度

安徽省地處華東腹地，淮河、長(zhǎng)江將全省分為淮北、江淮和江南3大區(qū)域。玉米主產(chǎn)區(qū)主要集中在淮河以北，沿淮及其他地區(qū)種植面積相對(duì)偏少。受耕作制度、地形等多種因素的影響，玉米小斑病在安徽省不同地區(qū)發(fā)生具有一定的差異。本研究采用組織分離法和單孢分離法從安徽省合肥、阜陽(yáng)、滁州等8個(gè)玉米產(chǎn)區(qū)分離得到30株玉米小斑病菌，比較了30株小斑病菌的菌絲生長(zhǎng)速率、菌落特征、產(chǎn)孢量及孢子大小等生物學(xué)特性。結(jié)果顯示分離自同一地區(qū)的不同菌株及不同地區(qū)分離的菌株間其產(chǎn)孢量，菌絲生長(zhǎng)速率，孢子大小均存在顯著性差異；不同菌株的菌落顏色、質(zhì)地、大小存在明顯差異。在菌絲生長(zhǎng)速率方面，分離得到的30個(gè)菌株中，F(xiàn)Y1菌株的菌絲生長(zhǎng)速率最大，生長(zhǎng)速率為1.33 cm/d； BB2菌株的生長(zhǎng)速率最小，為0.40 cm/d。在產(chǎn)孢量方面，產(chǎn)孢量最大的菌株是BB7，培養(yǎng)至第10天時(shí)其產(chǎn)孢量為25.02×104個(gè)/mL；產(chǎn)孢量最低的菌株是BB2，培養(yǎng)至第10天時(shí)仍未產(chǎn)孢。在分生孢子大小方面，F(xiàn)Y1菌株的分生孢子長(zhǎng)度最大，最小的為BB2菌株；分生孢子寬度最大的為FY3菌株，最小的為BB1菌株。綜合分析菌絲生長(zhǎng)速率、菌落顏色、產(chǎn)孢量及分生孢子大小數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，菌落顏色較深的菌株其產(chǎn)孢量相對(duì)偏大，菌絲生長(zhǎng)速率相對(duì)偏小，但上述生物學(xué)特性與采樣地點(diǎn)沒(méi)有直接的相關(guān)性。在下一步研究中，將進(jìn)一步探討生物學(xué)特性與致病性、抗藥性及遺傳多樣性之間的相互關(guān)系，為指導(dǎo)安徽省玉米小斑病的防治奠定基礎(chǔ)。