孫曉璐王明躍張 源

SUN Xiao-lu1 WANG Ming-yue1 ZHANG Yuan2

(1. 阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 阜陽 236031； 2. 阜陽師范學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

(1. Fuyang Vocational Technical College, Fuyang, Anhui 236031, China; 2. Fuyang Normal University, Fuyang, Anhui 236037, China)

酯酶(Esterase E.C.3.1.1.2)也被稱作羧基酯酶，在白酒行業(yè)中常稱為酯化酶或酯分解酶，是由一類具有酸、醇酯化功能的特定微生物發(fā)酵產(chǎn)生[1-2]。研究[3]表明，酯酶大量存在于酵母菌、霉菌及其他細菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，既可以水解酯類也可以催化合成低級脂肪酸酯。白酒發(fā)酵大曲中含有大量的能夠產(chǎn)酯化酶的功能性菌(包含細菌、酵母菌、霉菌等)，其代謝產(chǎn)物是構(gòu)成白酒風(fēng)味的前提[4]。其中，霉菌作為一類白酒釀造過程中重要的產(chǎn)酯化酶菌之一，所產(chǎn)生的酯化酶能夠?qū)⒓核岷鸵掖即呋铣蔀闃?gòu)成白酒主體呈香物質(zhì)的己酸乙醇[5-6]。因此，近年來能夠催化酸、醇縮合的產(chǎn)酯化酶菌株逐漸成為釀酒行業(yè)的研究熱點[7]。眾多學(xué)者[8-9]分別通過篩選代謝產(chǎn)酯化酶活力較高的菌株，催化己酸乙酯的合成，并與己酸菌復(fù)合使用，極大地提高了己酸乙酯的合成效率，從而達到提高白酒品質(zhì)、縮短發(fā)酵周期的目的。針對酒體增香，國內(nèi)外研究較多的是紅曲菌酯化酶酯化生成己酸乙酯[10-12]，但是對于犁頭霉產(chǎn)酯化酶菌株的研究還未見報道。

目前，在白酒大曲中不同霉菌的鑒定大多采用基于ITS rDNA 的分子生物學(xué)方法。例如，Li[13]和Wang等[14]分別采用分子生物學(xué)方法從芝麻香型白酒大曲及濃香型白酒大曲中鑒定了高產(chǎn)酯化酶的Schlegelellasp和Absidiablakesleeana菌株；Li等[15]通過ITS rDNA基因序列分離鑒定了中國傳統(tǒng)醋大曲中的典型微生物。主要是因為該類方法直接對目標菌種的DNA進行提取，通過分析所提取的DNA種類，確定目標菌群的種類，是目前分析微生物菌群中常用的分子生物學(xué)方法。并且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用ITS rDNA基因序列對微生物進行種屬鑒定已經(jīng)在不同領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

本研究首先用生理生化的方法對白酒中溫大曲中的菌株進行初步篩選分離，篩選出能夠高產(chǎn)酯化酶的菌株，然后采用基于ITS rDNA基因的分子生物學(xué)方法對菌株進行鑒定，并確定該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，在彌補白酒犁頭霉分離鑒定等相關(guān)研究空白的基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到白酒大曲產(chǎn)酯化酶犁頭霉的發(fā)酵條件，以期為提高大曲中酯含量及提高優(yōu)質(zhì)酒率等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：安徽金種子酒業(yè)有限公司；

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DNA Marker：生工生物工程(上海)股份有限公司；

DNA聚合酶、pMD19-T Vector：寶生物工程(大連)有限公司；

Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；

氯化鈉、葡萄糖、EDTA、CTAB、SDS等其他生化試劑：分析純，市售；

平板篩選培養(yǎng)基：按照牛肉膏3 g，蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL配制培養(yǎng)基，然后將3%的聚乙烯醇溶液和三丁酸甘油酯按照9∶1(體積比)混合均勻即為乳化液，最后將培養(yǎng)基與乳化液按照4∶1(體積比)混合均勻，121 ℃滅菌20 min；

種子培養(yǎng)基：瓊脂20 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，1/3 000的孟加拉紅溶液100 mL，蒸餾水1 000 mL，混合均勻后121 ℃滅菌20 min；

固體培養(yǎng)基：麩皮1 000 g，玉米粉100 g ，豆粕200 g，硫酸銨20 g，蒸餾水1 000 mL，混合均勻后121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器設(shè)備

電子精密天平：AY120型，北京賽多利斯天平有限公司；

滅菌鍋：TOMY-SX-700型，美國Tomy公司；

超凈工作臺：SW-CJ-IBU型，蘇州蘇凈集團；

高速離心機：5418型，芬蘭Eppendorf公司；

pH計：Orion 3 STAR型，美國Thermo公司；

光學(xué)顯微鏡：Eclipse 80i型，日本Nikon公司；

多功能搖床：HYL-A型，太倉強樂實驗儀器有限公司；

PCR儀：PTC100TM型，美國Thermo公司；

高電流電泳儀：PowPacTM HC164-5052型，美國Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；

全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀：JS-380C型，上海培清科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株初篩 將大曲原料磨碎過60目篩，稱取20 g大曲原料添加到裝有200 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，25 ℃浸泡1 h。3層紗布過濾收集濾液。分別將濾液按照梯度稀釋法稀釋為10-2～10-6個/mL的菌懸液。然后取0.2 mL不同梯度的菌懸液并均勻涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，每個稀釋梯度做3個平行，將涂布好的平板培養(yǎng)基置于35 ℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d。分別測定菌落周圍出現(xiàn)的透明圈(D)與菌落直徑(d)的比值。選擇D/d較大的菌株進行編號，然后將其保藏于20%的甘油管中，于-20 ℃貯藏。

1.3.2 菌株復(fù)篩 將初選得到的菌株在平板上進行活化后，制備成1×107個/mL的孢子懸液，然后取上述懸液1 mL于100 mL的種子培養(yǎng)基中，調(diào)整培養(yǎng)箱溫度為35 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)2 d。取2 mL涂布于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35 ℃培養(yǎng)3 d，取出后50 ℃烘干，然后測定其酯化酶活力。

1.3.3 酶活力測定

(2) 酯含量測定：采用皂化法[17]。

1.3.4 菌株鑒定方法

(1) 形態(tài)觀察：采用美藍染色液進行染色，做壓片處理后于40×油鏡下觀察，記錄細胞形態(tài)特征、細胞大小、出芽情況。置于熒光倒置顯微鏡下進行采集，得到相關(guān)霉菌形態(tài)圖像，進行形態(tài)學(xué)觀察。

(2) 基因組DNA的提?。喊床僮髡f明書，使用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進行真菌基因組DNA的提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行PCR擴增。

(3) ITS rDNA分子鑒定：使用通用引物5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′, 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′擴增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2，PCR反應(yīng)體系為25 μL。PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，然后在72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為100 V。將條帶采用 DNA 膠回收試劑盒(Omega)進行切膠回收，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

(4) 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將測得序列在Gen Bank 中用Blast程序進行相似性分析，用ClustalX 1.8進行多序列對比分析，利用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

(5) Biolog鑒定：挑選培養(yǎng)平板上的單個菌落，采用Biolog專用培養(yǎng)基將菌株進行純化，配制一定細胞濃度的菌懸液，將菌懸液接種至特定鑒定板培養(yǎng)一定時間，經(jīng)Biolog微生物鑒定儀鑒定。

照片中，正在尋找行李空間的杰斯納（Jessner）意外地打開了車尾的發(fā)動機蓋；另一位編輯施巴爾（Sparrer）則在專心致志地編輯著短信，而這就是我們在制作選題時的日常?？菰?？當然不會。因為在這些乏味照片的背后，測試充滿了樂趣與激情。

1.3.5 菌株LD06的發(fā)酵條件確定

(1) 碳源選擇及最適添加量的確定：根據(jù)1.1中固體培養(yǎng)基的配制方法，分別以淀粉、玉米粉、果糖、葡萄糖、蔗糖作為碳源配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基，添加量為1 g，36 ℃培養(yǎng)4 d后測定酶活力，確定最佳碳源。然后選擇最佳碳源添加量為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g時，測定酶活力以確定最佳碳源添加量。

(2) 氮源選擇及最適添加量的影響：根據(jù)1.1中固體培養(yǎng)基的配制方法，分別以蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、酵母粉、硫酸銨、豆粕粉為氮源配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基，添加量為1 g，36 ℃ 培養(yǎng)4 d后測定酶活力，確定最佳氮源。然后選擇最佳氮源添加量為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g時，測定酶活力以確定最佳氮源添加量。

(3) 其他組成的影響：根據(jù)1.1中固體培養(yǎng)基的配制方法，分別在確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源、碳源及其添加量后，各添加大豆油1 g/100 g·培養(yǎng)基，Tween 80 1 g/100 g·培養(yǎng)基，亞麻籽油1 g/100 g·培養(yǎng)基，葵花籽油1 g/100 g·培養(yǎng)基，乙醇5 g/100 g·培養(yǎng)基，乳酸0.4 g/100 g·培養(yǎng)基，研究不同的添加物對酶活力的影響[16-17]。

(4) 發(fā)酵條件對菌株LD06產(chǎn)酶的影響：在確定固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上(麩皮10 g，玉米粉1.5 g、酵母粉2.0 g、亞麻籽油1 g/100 g·培養(yǎng)基、硫酸銨0.2 g、蒸餾水10 mL)，固定發(fā)酵溫度分別為32，36，40 ℃時，不同發(fā)酵時間36，39，42，45，48，51，54 h對菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010進行整理及作圖，試驗數(shù)據(jù)用SAS 8.2(SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA)統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)，不同平均值之間利用Fisher’s 最小顯著差異法(LSD)進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。所有試驗都是隨機抽取3個重復(fù)(n=3)進行指標分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酯化酶霉菌菌株的篩選

2.1.1 初篩結(jié)果 將試驗大曲涂布后于35 ℃培養(yǎng)4 d，根據(jù)試驗條件選取D/d相對較大的8株菌株，具體編號見表1。從表1中選取D/d較大的4個菌株進行復(fù)篩。

表1 菌株初選結(jié)果?

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果 將4個菌株接種到種子培養(yǎng)基中，恒溫搖瓶培養(yǎng)2 d后涂布于固體培養(yǎng)基上，35 ℃靜置培養(yǎng)3 d，分別測定不同菌株的酯化力，見表2。從表2可以看出，菌株LD06有最高的酯化力為7.605 g/L。因此，選用該菌株進行后續(xù)的研究。

2.2 高產(chǎn)酯化酶菌株LD06的形態(tài)特征及生理生化鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征 將菌株LD06在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，菌絲呈白色長毛狀，不產(chǎn)色素，具有典型的霉菌菌落特征，見圖1(a)。通過在顯微鏡下觀察可以看出[圖1(b)]，菌株LD06菌絲存在較多的分支、無匍匐菌絲和假根、具隔、頂端膨大形成圓形的孢子囊。

表2 菌株復(fù)篩結(jié)果?

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖1 LDO6菌株的菌落形態(tài)

2.2.2 高產(chǎn)酯化酶LD06菌株基于16S rDNA基因的分子生物學(xué)鑒定 從圖2可以看出，菌株ITS rDNA基因片段的擴增產(chǎn)物約為600 bp的單一DNA條帶，與引物設(shè)計的目標片段大小相符。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶，連接到pMD19-T載體上進行測序。測序結(jié)果表明，擴增片段長度為666 bp個堿基序列。

M. DNA標準分子量 1. rDNA

將菌株LD06的ITS rDNA基因序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，選取與菌株LD06 ITS rDNA基因同源性較高的菌株的ITS rDNA序列進行比對，利用DNAMAN構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，菌株LD06與Lichtheimiaramosastrain(KY072930.1)、LichtheimiacorymbiferastrainF49(KF278648.1)相似度均為99%。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物綜合分析初步鑒定菌株LD06是Lichtheimiacorymbifera或Lichtheimiaramosa。

圖3 基于ITS rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.3 高產(chǎn)酯化酶LD06菌株Biolog鑒定 Biolog鑒定方法是一種新型微生物鑒定方法，目前已廣泛應(yīng)用于大曲、窖泥等微生物的分離、純化、鑒定。本研究將LD06通過Biolog微生物鑒定儀鑒定，具體見表3。從表3可以看出，菌株LD06為Absidiacorymbifera(Cohn)Saccardo(傘枝犁頭霉)。

表3 Biolog鑒定結(jié)果

2.3 菌株LD06的發(fā)酵條件

2.3.1 培養(yǎng)基組成對菌株LD06產(chǎn)酶的影響

(1) 碳源及添加量：從圖4(a)可以看出，淀粉和玉米粉作為碳源更適合于菌株LD06產(chǎn)酯化酶。比較2種碳源可以得出，玉米粉作為碳源時，LD06產(chǎn)酯化酶的能力最強，分析原因主要是該類碳源中可能含有其他諸如維生素、氨基酸等促生長因子。因此，研究中選用玉米粉作為LD06產(chǎn)酯化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，不同的玉米粉添加量對菌株LD06產(chǎn)酯化酶的能力的影響結(jié)果見圖4(b)。當玉米粉添加量低于1.5 g時，由于培養(yǎng)基中碳源添加量太低，影響了菌株的生長及產(chǎn)酯化酶；而當玉米粉添加量超過1.5 g時，過量的碳源會極大地促進菌株的生長，加速了菌體代謝及凋亡的速率，從而降低了酯化酶的產(chǎn)量。因此，當玉米粉添加量為1.5 g時，能顯著提高菌株LD06產(chǎn)酯化酶的能力。

(2) 氮源及添加量：在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1.5 g玉米粉作為碳源，氮源種類對LD06產(chǎn)酯化酶的影響結(jié)果見圖5(a)。從圖5(a)可以看出，酵母粉是菌株LD06產(chǎn)酯化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中最合適的氮源，其次為黃豆粉和豆粕粉。

酵母粉添加量對LD06產(chǎn)酯化酶的影響作用見圖5(b)。從圖5(b)可以看出，酵母粉添加量對酯化力有顯著的(P<0.05)影響，表現(xiàn)為酵母粉添加量低于2.0 g/L時，酯化力顯著(P<0.05)增加，而當酵母粉添加量超過2.0 g時，LD06產(chǎn)酯化酶顯著(P<0.05)降低。因此，選擇2.0 g的酵母粉作為菌株LD06產(chǎn)酯化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

(3) 其他添加物：從圖6可以看出，與對照組相比，油脂類添加物能夠顯著(P<0.05)提高LD06產(chǎn)酯化酶的能力，但是表面活性劑(tween 80)、乙醇、乳酸對LD06產(chǎn)酯化酶的影響較小。主要是因為，在釀酒大曲中通過添加油類物質(zhì)，可以促進霉菌菌株的生長和產(chǎn)酶量。Hama等[19]研究表明，油脂類成分不但可以作為酯化反應(yīng)的產(chǎn)物，促進酯化反應(yīng)的進行；還可以通過與霉菌細胞膜的作用，影響細胞膜的通透性，表現(xiàn)為促進酯化酶向細胞外分泌。因此，在后續(xù)的研究中采用1%亞麻籽油作為菌株LD06產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵誘導(dǎo)物質(zhì)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 發(fā)酵條件對菌株LD06產(chǎn)酶的影響 從圖7可以看出，36 ℃是菌株LD06的最適發(fā)酵溫度，過高或過低都會降低其產(chǎn)酯化酶的能力。另外，在不同的發(fā)酵溫度條件下，隨著發(fā)酵時間的延長，菌株LD06產(chǎn)酯化酶的能力呈先增加后降低趨勢。表現(xiàn)為當發(fā)酵溫度為36 ℃、培養(yǎng)時間為36～45 h 時，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物在體系中大量生長，大量的菌株LD06布滿培養(yǎng)基中，使酯化力顯著(P<0.05)增加至最高；當發(fā)酵時間超過45 h并繼續(xù)增加時，酯化酶活力不斷降低，主要因為培養(yǎng)時間過長會導(dǎo)致菌株的菌絲逐漸衰老，并且產(chǎn)生了大量的孢子，導(dǎo)致產(chǎn)酶量逐漸降低。因此，發(fā)酵溫度36 ℃、發(fā)酵時間45 h是菌株LD06發(fā)酵產(chǎn)酶的最適條件。

因此，綜合上述結(jié)果可以看出，菌株LD06產(chǎn)酯化酶的固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麩皮(基質(zhì))10 g，玉米粉(碳源)1.5 g、酵母粉(氮源)2.0 g、亞麻籽油(誘導(dǎo)物)1 g/100 g·培養(yǎng)基、硫酸銨0.2 g、蒸餾水10 mL；發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度36 ℃、時間45 h。該條件下得到的酯化力為9.32 g/L，與初始酯化力相比提高了22.55%。

圖7 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間對酯化酶活力的影響

3 結(jié)論

本試驗以中溫大曲為原料，從中篩選能夠產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵菌種并鑒定其種類，研究該菌株產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件。通過形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定及Biolog鑒定結(jié)果確定該菌株為犁頭霉，進一步證實了研究中采用菌株鑒定方法準確可靠。另外，本研究以酯化力為目標值，優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵培養(yǎng)條件，與初始酯化力相比提高了22.55%，與劉維英等[9]、滕巍等[16]對產(chǎn)酯化酶菌株發(fā)酵條件的研究結(jié)果相比存在差異，是對白酒大曲產(chǎn)酯化酶菌株相關(guān)研究的補充。

本研究僅涉及了犁頭霉的分離鑒定及其產(chǎn)最高酯化酶活力的發(fā)酵條件優(yōu)化，未涉及到該犁頭霉產(chǎn)酯化酶的結(jié)構(gòu)、作用條件等。因此，對該酯化酶的篩選及酶學(xué)特性等有待進一步深入研究。