李志艷 趙翀 劉靜 張欣 朱德銳 陳筠

研究發(fā)現(xiàn)，菌斑微生物是牙周炎發(fā)生的起始因子，受到宿主的遺傳背景、飲食、生活環(huán)境及文化背景等因素的制約影響[1-2]。牙周病可疑致病菌主要有福賽斯坦納菌、伴放線菌嗜血菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、中間普氏菌、齒垢密螺旋體等[3-4]。青海地區(qū)地處高原，多民族聚居，漢族人群約占53.02%，高原缺氧等因素會(huì)對(duì)厭氧菌和牙周組織均造成影響，且牙周病患病率較其他平原地區(qū)高[5-6]。目前，有關(guān)口腔微生物的研究采用高通量測(cè)序技術(shù)(high throughput sequencing)是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[7-8]，相關(guān)研究在青海地區(qū)研究報(bào)道甚少。本研究采用16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)探究青海漢族牙周病患者口腔微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)，為后期口腔疾病的預(yù)防、診斷與治療提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

病例選自青海大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科門(mén)診慢性牙周炎患者10 例、正常人群(對(duì)照組)5 例唾液樣本共15 例，其中長(zhǎng)期在青海居住10 年以上，男7 人，女8 人，年齡范圍39～66 歲以上，平均年齡(45.6±2.54) 歲。其中慢性牙周炎患者 (根據(jù)第三次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)[9])，納入標(biāo)準(zhǔn)：①牙周袋深度(PD)≥4 mm或附著喪失量(AL)≥2 mm；② X線片示牙槽骨吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/3。所有選取的對(duì)象無(wú)糖尿病、心血管病、甲亢等系統(tǒng)性疾病。過(guò)去3 個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)抗生素和消炎藥物等,就診前6 個(gè)月內(nèi)未做口腔治療,并排除侵襲性牙周炎。

1.2 樣本采集

唾液樣本的收集：清晨起床后，刷牙洗漱之前或兩餐之間，于10 點(diǎn)鐘左右或16 點(diǎn)鐘左右。采集樣本前讓受檢者用溫開(kāi)水輕輕漱去口中的食物殘?jiān)?，然后采集口腔自然排出的唾液于無(wú)菌容器內(nèi)，唾液量0.5～1.0 ml。蓋上管口或容器蓋立即送檢，不能及時(shí)送檢的唾液最好加蓋少量無(wú)菌石蠟油以隔絕空氣。

1.3 基因組DNA的提取及質(zhì)量控制

樣本于0.22 μm 細(xì)菌濾膜上進(jìn)行真空抽濾，將濾膜剪碎放入DNA 試劑盒(QI Aamp Fast DNA Stool Mini Kit,Qiagen，德國(guó))，參照試劑盒步驟提取基因組DNA，2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析環(huán)境樣本DNA完整性。DNA質(zhì)量純度檢測(cè)分析采用微量檢測(cè)儀Microplate Reader(MD公司,USA)，合格樣品總DNA保存于-80 ℃。

1.4 PCR擴(kuò)增16S rDNA和測(cè)序分析

細(xì)菌使用16S rRNA基因通用引物341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和785R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)進(jìn)行V3-V4目的基因擴(kuò)增(ABI Gene Amp 9700, USA)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃(5 min)，94 ℃(45 s)，55 ℃(30 s)，72 ℃(90 s)，共35 個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸5 min。采用Axyprep DNA Gel Extraction Kit(Axygen scientific,USA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化；采用Qubit?2.0熒光計(jì)(Invitrogen, USA)進(jìn)行DNA精準(zhǔn)定量分析。檢測(cè)合格的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行16S rRNA基因量測(cè)序(MiSeq/454/Sanger,3730xl,ABI,USA)，由上?；菅猩锟萍加邢薰就瓿?，每個(gè)樣本獲得雙端序列數(shù)據(jù)為2～3 萬(wàn)個(gè)reads。根據(jù)測(cè)序reads之間overlap關(guān)系進(jìn)行拼接(merge)，同時(shí)對(duì)reads質(zhì)量和merge效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾(Q30>80%)，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分，優(yōu)化有效序列。

1.5 測(cè)序結(jié)果分析

使用QIIME 1.8.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，在相似度97%水平上聚類出可操作分類單元OTU(Operational taxonomic unit)，進(jìn)行OTU picking和物種注釋分析。使用alpha稀釋曲線(Alpha rarefaction.py)計(jì)算了樣品的菌群多樣性香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、譜系多樣性(PD whole tree)、觀察物種(Observed species)和菌種豐富度指數(shù)chao1，以及基于OTU進(jìn)行主成分分析(PCA, principal component analysis)。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果(綱Classes、屬Genera與種Species)分析微生物的群落結(jié)構(gòu)、物種組成比例及豐度[9]。

2 結(jié) 果

2.1 高通量測(cè)序深度分析

通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)青海牙周病患者與正常人群口腔唾液樣本細(xì)菌16S rRNA基因(V3-V4區(qū))生物多樣性檢測(cè)，共計(jì)獲得10 587條reads，每個(gè)樣本平均讀取706 條reads，平均讀長(zhǎng)250 bp。隨著樣本測(cè)序深度的增加，稀釋曲線趨向平坦，獲得的OTU數(shù)目變化不大，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。在相似度97%水平上聚類OTU，并進(jìn)行OTU picking，獲得青海地區(qū)牙周病患者組與正常人群口腔唾液樣本微生物物種注釋OTU數(shù)目分別為60和14。表明青海地區(qū)牙周病患者組的總觀察物種數(shù)量明顯多與正常組。

2.2 群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)種群分析

通過(guò)在Ribosomal Database Project(RDP)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行相似性比對(duì)，并分別在門(mén)、綱、屬的層次下對(duì)各樣品物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 (圖 1)。牙周病組優(yōu)勢(shì)種群細(xì)菌依次為(相對(duì)豐度>1%)：腸桿菌科未分類種(Enterobacteriaceaeunclassified)、假單胞菌屬未知種(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬未知種(Acinetobacter)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、氣單胞菌科未分類種(Aeromonadaceae)、約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii)、奈氏球菌屬未知種(Neisseria)、梭桿菌屬未知種(Fusobacterium)、金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副流感嗜血桿菌(Haemophilusparainfluenzae)、乳球菌屬未知種(Lactococcus)、肺嗜冷桿菌(Psychrobacterpulmonis)、Wautersiella、鏈球菌屬未知種(Streptococcus)、魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)。正常組有4 種優(yōu)勢(shì)菌屬僅檢測(cè)出4 類種群Mucilaginosasp.、Enterococcussp.、乳酸桿菌目未分類種(Lactobacillalesunclassified)和Chryseobacteriumsp.。綜上分析表明，患病組的微生物種類繁多，而正常組微生物種類相對(duì)單一。牙周病組的門(mén)綱分類和群落結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜于正常組，表明牙周病發(fā)生與口腔微生物群落變化存在相關(guān)性。

2.3 微生物多樣性性分析

基于OTU注釋和測(cè)序統(tǒng)計(jì)進(jìn)行微生物多樣性分析(表 1)，表明牙周病組檢測(cè)出觀察物種數(shù)量大于正常組觀察物種數(shù)量，此結(jié)果與高通量測(cè)序獲得的OTU豐富度Chao1指數(shù)結(jié)果相一致。Shannon指數(shù)結(jié)果分析表明牙周病組的微生物多樣性顯著高于正常組。根據(jù)PD whole tree指數(shù)顯示，牙周病組(0.86～2.33)的微生物系統(tǒng)發(fā)育距離總和大于正常組(≤1.00)，表明牙周病可疑致病微生物群落結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)遠(yuǎn)復(fù)雜于正常組，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系亦趨于復(fù)雜。

圖 1 微生物種水平相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)分析牙周病患者(Y)、正常組(C)

表 2 西寧市漢族人群牙周病患者(Y)和正常者(C)口腔微生物多樣性統(tǒng)計(jì)分析

注：菌株單一，無(wú)統(tǒng)計(jì)意義

3 討 論

目前，高通量Illumina MiSeq測(cè)序是微生物多樣性研究的重要技術(shù)手段，測(cè)序精確，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，可全面反應(yīng)復(fù)雜樣品的微生物群落的組成。本研究通過(guò)高通量測(cè)序的方法對(duì)青海漢族牙周病組(10 例)、正常組(5 例)口腔唾液樣本中的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了初步研究，物種注釋篩選獲得青海地區(qū)牙周病組60 個(gè)OTU，共計(jì)5 門(mén)9 綱33 屬；正常人群組14 個(gè)OTU，共計(jì)2 門(mén)2 綱4 屬。可見(jiàn)牙周病組口腔微生物物種明顯較正常人多，說(shuō)明菌斑微生物和牙周炎的發(fā)病是密切相關(guān)的。

本研究2 組樣本(15 例)的物種豐度統(tǒng)計(jì)分析，牙周病組檢測(cè)出的微生物種類較多，包括有變形菌門(mén)(Proteobacteria，78.24%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，16.33%)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria，2.44%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，2.46%)。正常組的檢出種類主要是Proteobacteria(檢出率為26.73%)和Firmicutes(檢出率為41.82%)。吳芳等[10]采用16S rRNA基因克隆文庫(kù)法分析甘肅東鄉(xiāng)族牙周炎患者和健康人(各5 例)唾液微生物多樣性，檢出牙周炎患者的主要類群是Firmicutes(53.80%)、Proteobacteria(23.10%)、Bacteroidetes(11.0%)和Fusobacteria(4.0%)。通過(guò)比較分析可知，口腔微生物的組成類群基本一致，微生物群落結(jié)構(gòu)變化和豐度比例不盡相同，這可能與受試者居住環(huán)境、生活習(xí)慣的差異而造成，處于低壓、低氧等環(huán)境因素導(dǎo)致口腔內(nèi)大多數(shù)細(xì)菌營(yíng)兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活的變形菌門(mén)豐度比例較高，而牙周病患者口腔內(nèi)，由此亦表明口腔常見(jiàn)疾病的發(fā)生與發(fā)展，是口腔內(nèi)多種微生物共同作用的結(jié)果。

口腔微生物常以群體的方式導(dǎo)致各種口腔疾病，群體中的每一個(gè)個(gè)體均參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，即使是低豐度的成員依然可能作為復(fù)雜的群落行為表現(xiàn)的關(guān)鍵物種[11]。牙周炎是由牙菌斑中多種微生物引發(fā)的牙周組織慢性感染性炎癥疾病。研究表明，卟啉單胞菌(Porphyromonas)、齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)、福賽斯坦納菌(Tannerellaforsythia)、擬桿菌(Bacteroides)、隱藏真桿菌(Eubacteriumsaphenum)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus)、 棲石普雷沃菌(Prevotelladenticola)、 微小微單胞菌(Parvimonasmicra)、小桿菌(Dialister)、齦溝產(chǎn)線菌(Filifactoralocis)、 脫硫球莖菌(Desulfobulbusspecies)，互養(yǎng)菌和齦溝螺桿菌等與該病密切相關(guān)[12]。吳芳等[13]對(duì)照分析牙周炎患者與健康患者，其優(yōu)勢(shì)屬群依次為鏈球菌(Streptococcus,40.3%)、奈瑟氏球菌(Neisseria,11.4%)、兼性雙球菌(Gemella,6.02%)、韋榮球菌(Veillonella,4.22%)、聚糖桿菌(Aggregatibacter,3.16%)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas,3.01%)、福氏桿菌(Fusobacterium,2.14%)、嗜血桿菌(Haemophilus,2.14%)、纖毛菌屬(Leptotrichia,1.20%)、普氏菌(Prevotella,1.20%)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus,1.20%)和顆粒鏈菌 (Granulicatella,1.20%)。本研究檢測(cè)出牙周病組的優(yōu)勢(shì)菌依次為腸桿菌科未分類菌(Enterobacteriaceaeunclassified,47.41%)、假單胞菌(Pseudomonas,15.06%)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter,12.07%)、芽孢桿菌(Bacillus,7.04%)、氣單胞菌未分類菌(Aeromonadaceaeunclassified,4.46%)、奈瑟氏菌(Neisseria,2.53%)、嗜血桿菌屬(Haemophilus,2.32%)、梭桿菌(Fusobacterium,2.25%)、葡萄球菌(Staphylococcus,2.15%)、乳酸乳球菌(Lactococcus,1.95%)，比較分析表明青海漢族人群中，牙周病組可疑的致病微生物類群及豐度比例與已有諸多報(bào)道不一致，優(yōu)勢(shì)屬群亦明顯不同。其原因可能有以下幾點(diǎn)：①由于青海地區(qū)環(huán)境、氣候特征和飲食習(xí)慣的明顯差異造成的，青海地處高海拔地區(qū)，此環(huán)境下機(jī)體各系統(tǒng)各器官都產(chǎn)生不同程度的缺氧，使牙周厭氧菌生長(zhǎng)繁殖加快。在低氧環(huán)境下，口腔內(nèi)唾液分泌減少，口腔自潔功能減弱、加速了厭氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和菌群的形成；②可能與飲食有關(guān)，以面食為主，牛羊肉類和奶制品豐富；③青海省一直以來(lái)就是我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展較為落后的地區(qū)之一，對(duì)口腔保健方面認(rèn)識(shí)欠缺，因此，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)口腔衛(wèi)生健康教育、增強(qiáng)居民口腔保健意識(shí)；④本研究取樣僅選擇唾液樣本，而優(yōu)勢(shì)菌在唾液樣本中量少而未檢出或檢出率低，后續(xù)研究將進(jìn)一步改進(jìn)。

綜上述，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)初步對(duì)當(dāng)?shù)貪h族牙周病人群優(yōu)勢(shì)菌的認(rèn)識(shí)，可見(jiàn)牙周位點(diǎn)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的是革蘭陽(yáng)性菌而非革蘭陰性菌，亦初步揭示了此人群口腔疾病相關(guān)的微生物特征，其相關(guān)微生物菌群發(fā)生的顯著變化較多，而正?？谇粌?nèi)的微生物菌群變化相對(duì)保守。