胡紅梅 廖家萬 李偉 曾常愛

牙髓微環(huán)境中具有分化潛能的細胞可在信號分子的誘導下發(fā)生分化并形成修復性牙本質(zhì)。牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是由Gronthos等[1]于2000 年提出的概念，在牙組織修復過程中起著重要作用。DPSCs在增殖過程中一些信號通路被激活，其中較為重要的是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)家族的p38-MAPK和其下游基因信號傳導轉(zhuǎn)錄活化蛋白3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)，Lee等[2]和Wang等[3]研究發(fā)現(xiàn)p38-MAPK和STAT3參與了DPSCs 向成牙本質(zhì)細胞分化，并介導牙髓干細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，對細胞的分化指標堿性磷酸酶活性具有調(diào)控作用，但是其中的具體分子機制并不清楚。本實驗探討了微氧化應激下p38-MAPK信號通路和STAT3信號靶點對DPSCs增殖和分化的分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與主要儀器

DPSCs(保存于井岡山大學醫(yī)學部中心實驗室)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；CCK-8試劑盒(Sigma，美國)；PVDF膜(Bio-Rad，美國)；ECL增強化學發(fā)光檢測試劑盒(PIERCE，美國)；TEMED(Amersham Pharmacia Biotech，美國)；胰蛋白酶、蛋白裂解液(碧云天)；SB203580、AG490(Selleck，美國)；Trans-Blot?SD Cell半干轉(zhuǎn)儀、電泳儀(Bio-Rad，美國)；脫色搖床(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；圖像分析系統(tǒng)(LabworksTM Analysis Softwar，美國)；GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)(UVP，美國)。

1.2 方法

1.2.1 DPSCs微氧模型建立 DPSCs進行復蘇，置培養(yǎng)板于無菌密閉容器，進氣口通入含3%O2，92%N2，5%CO2混合氣體，經(jīng)出氣口流出，使容器內(nèi)保持微氧狀態(tài)，在此條件下培養(yǎng)細胞到相應時間點后進行檢測收樣。實驗分組情況：1組：常氧組(空氣，21%O2)；2組：常氧組+SB203580抑制(終濃度為20 μmol/L)；3組：常氧組+AG490(終濃度為65 μmol/L)；4組：微氧組；5組：微氧組+SB203580抑制(終濃度為20 μmol/L)；6組：微氧組+AG490(終濃度為65 μmol/L)。加藥處理組需在微氧前加入終濃度為20 μmol/L的SB203580抑制劑或者是加入終濃度為65 μmol/L的AG490抑制劑，然后再進行微氧處理。

1.2.2 CCK8檢測DPSCs增殖 取生長狀態(tài)良好的第3代DPSCs，制成單細胞懸液，計數(shù)調(diào)整細胞濃度至1×105/ml，待DPSCs貼壁以后，按照實驗分組處理細胞，每組設3 個復空，將培養(yǎng)板分別置于常氧箱和缺氧箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)DPSCs至12、24、36 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡)，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值，同時設置空白孔(培養(yǎng)基、CCK)，對照孔(未經(jīng)處理的DPSCs、培養(yǎng)基、CCK)。

1.2.3 礦化結(jié)節(jié)形成檢測 用濃鹽酸調(diào)節(jié)PBS溶液pH至4.2，稱取1 g茜素紅溶于100 ml中的溶液中，完全溶解，培養(yǎng)細胞貼壁以后，按照實驗分組處理細胞，PBS漂洗，4%多聚甲醛處理，茜素紅染液，雙蒸水沖洗，干燥，封片。

1.2.4 流式細胞儀檢查細胞周期 收集1～5×105DPSCs，加入1 ml冰浴預冷70%乙醇中，吹打混勻，4 ℃固定2 h，離心，沉淀細胞，吸除上清，加入0.5 ml碘化丙啶染色液，用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。

1.2.5 QRT-PCR檢測人DPSCs中ALP表達 ALP引物設計由上海生工合成，其ID:249，hALPF：GTGGCAACTCTATCTTTGGTCTG，hALPR：CGCCTGGTAGTTGTTGTGAGC，長度158 bp；內(nèi)參基因hactinf：TGACGTGGACATCCGCAAAG，hactinr：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG，長度205 bp。提取RNA，將RNA 沉淀溶解于適量(20～50 μl)的無RNase水中。反轉(zhuǎn)錄反應體系的配制(總體積20 μl)：2×RT buffer 10 μl，6 N隨機引物(100 pmol/μl) 1 μl，RT-mix 1 μl，模板(RNA) 5 μl，DEPC水3 μl，條件的設置：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min；熒光定量PCR反應體系的配制：(總體積50 μl)，2×PCR buffer 25 μl，Primers(25 pmol/μl)1 μl×2，Sybr green I(20*)0.5 μl，模板*(cDNA)2 μl，DEPC水20.5 μl，熒光定量PCR擴增條件的設置：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循環(huán)35 次，72 ℃檢測信號。

1.2.6 WB檢測人DPSCs中 PCNA表達 首先總蛋白提取，使用分光光度計測定562 nm處的吸光度值，測定時，使用1 ml比色皿，用ddH2O校零，盡可能在20 min內(nèi)檢測完畢所有樣品，各濃度BSA標準品溶液的吸光度值減去Blank值的平均值，繪制 BSA 標準品溶液的標準曲線，SDS-PAGE電泳，電泳條件:120 V，10 min，200 V，30 min，將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、PVDF膜(經(jīng)甲醇活化)、濾紙、海綿墊，同時將電泳液換成轉(zhuǎn)移液，取出膜，并做好正反面標記，在TBST中清洗1 min，然后用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，用封閉液將對應的一抗稀釋成一定的濃度(1∶500)，內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1∶1 000，然后溫育1.5 h或4 ℃孵育過夜。用TBST洗3 次，每次5 min，用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1∶1 000)，然后溫育1.5 h，曝光檢測。

2 結(jié) 果

2.1 DPSCs形態(tài)學觀察

DPSCs在培養(yǎng)21 d 后，倒置相差顯微鏡下可見細胞呈長梭形并貼壁生長，傳代后的細胞增殖迅速且呈漩渦狀排列，部分可出現(xiàn)集落生長，集落間細胞分散，形狀類似成纖維細胞樣，細胞較大，培養(yǎng)21 d的光鏡照片，放大倍數(shù)為100 倍，細胞形態(tài)為長梭型，融合成單層細胞(圖 1)。各組之間的細胞形態(tài)都呈長梭型，常氧各個組的細胞數(shù)量較密集，數(shù)量較多，微氧各個組的細胞相對數(shù)量較少，差別比較明顯。

圖 1 6組培養(yǎng)的細胞形態(tài)

2.2 CCK8檢測牙髓干細胞增殖活性的結(jié)果

DPSCs在微氧微環(huán)境中生長時，較其在常氧微環(huán)境中生長的吸光度值低，尤其在培養(yǎng)36 h后更加明顯，在12、24 h 各微氧組的光吸收度值變化幅度較?。欢Ｑ踅M吸光度值增加較多(圖 2)，在36 h時抑制p38-MAPK時變化較明顯，經(jīng)SPSS 17.0分析，各微氧組的光吸收度值與常氧組的光吸收度值相比，在24、36 h均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，顯示常氧環(huán)境下抑制p38-MAPK時更能促進 DPSCs細胞的增殖，而微氧環(huán)境下抑制STAT3致細胞增殖不明顯，而且在各組牙髓干細胞不同時間段存活率顯示(表 1)，常氧環(huán)境及常氧環(huán)境下抑制p38-MAPK時DPSCs細胞的存活率也較高，且與各組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖 2 各組DPSCs生長曲線圖

2.3 礦化結(jié)節(jié)的形成情況

各微氧組及常氧組DPSCs均見橘紅色礦化結(jié)節(jié)(即鈣結(jié)節(jié))形成(圖 3)，其中微氧各個組形成的礦化結(jié)節(jié)大小及數(shù)量較多，尤其微氧且抑制STAT3組顯示有大量的細胞礦結(jié)節(jié)，常氧組抑制p38-MAPK組的細胞礦化結(jié)節(jié)較少，且細胞數(shù)量也較少。提示微氧環(huán)境可以更好的促進牙齒硬組織的形成，STAT3信號分子和p38-MAPK通路的激活在牙齒硬組織的形成中可能存在相反的作用。

2.4 流式細胞儀檢測 DPSCs增殖周期情況

微氧各組和常氧各組的DPSCs的細胞周期、二倍體水平的流式細胞檢測儀檢測結(jié)果見表 2和圖 4。由圖可見，當DPSCs在常氧且抑制p38-MAPK通路時，在各組中細胞分裂最為旺盛；當DPSCs在微氧且抑制STAT3信號分子時，在各組中細胞分裂最不明顯，通過SPSS 17.0軟件分析，微氧且抑制STAT3信號分子組和其它各組的細胞分裂指數(shù)(PI)具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明 DPSCs體外培養(yǎng)時，當培養(yǎng)微環(huán)境為常氧時，不論是抑制p38-MAPK通路還是STAT3信號分子時，都可以明顯促進細胞的分裂。

表 1 6 組DPSCs不同時間段存活率

表 2 6 組DPSCs增殖周期的影響

注：①第6組與其它組比較,P<0.05

2.5 QRT-PCR檢測DPSCs中ALP表達情況

各組的DNA溶液作為模板進行QRT-PCR 擴增，本實驗擴增效率均在R2=0. 997 8，均方差=0.095 3，斜率-3.417 7，截距=46.422 6，說明擴增效率接近100%，提示不同梯度定量模板的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)之間，相關(guān)關(guān)系較好，證明數(shù)據(jù)可靠性較高。表 3顯示微氧組和微氧且抑制STAT3組的相對比值明顯高于其它組，證明mRNA表達多，即ALP表達情況較高，通過單因素方差分析P<0.05，說明這幾組之間的差別是有顯著性。熔解曲線分析結(jié)果顯示目的基因熔解曲線如圖 5所示，ALP PCR產(chǎn)物以及標準品(內(nèi)參)均在大于84 ℃以上獲得單一熔解峰，說明在該反應條件下，擴增反應產(chǎn)物溶解溫度較均一，目的基因具有很好的特異性，反應體系良好。

圖 3 6 組的細胞茜素紅染色

圖 4 流式細胞分析圖

表 3 ALP Q-PCR擴增數(shù)據(jù)

注：①第6組及第4組與其它組比較,P<0.05

圖 5 ALP擴增曲線和熔解曲線

圖 6 BSA 標準品溶液的標準曲線

圖 7 Westernblot檢測PCNA蛋白的表達

2.6 WB檢測人DPSCs中PCNA表達

標準曲線的R值為0.995 3，說明本次曲線擬合度較好。通過DPSCs的蛋白質(zhì)含量Western blot檢測以及灰度值發(fā)現(xiàn)，在相同的實驗條件下，各組均檢測到目的基因的表達，顯示常氧環(huán)境下抑制p38-MAPK時積分光密度較高，而微氧環(huán)境下抑制STAT3致積分光密度較低，說明常氧且抑制p38-MAPK時細胞增值率高，而微氧且抑制STAT3時細胞增值率低，且與各組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖 6～7，表 4)。

表 4 PCNA蛋白條帶灰度值分析

3 討 論

有關(guān)DPSCs增殖、分化的組織調(diào)控內(nèi)外環(huán)境因素比較復雜，為了達到組織工程化應用的目的，國內(nèi)一些學者進一步開拓了研究視野[4-5]。但是目前DPSCs大多是在體外氧張力為(18%～21%O2)的空氣中培養(yǎng)，細胞沒有受到自身牙髓中的微環(huán)境的控制，因此DPSCs的增殖分化效果難以評估。Kim等[6]認為微氧環(huán)境下細胞表現(xiàn)出生長速度加快，集落增多；Dos等[7]也認為氧濃度降低有助于維持細胞的活性，但有學者卻認為持續(xù)性微氧環(huán)境抑制細胞增殖，低氧不利于細胞生長，表現(xiàn)為細胞的增殖能力受抑制、細胞周期停滯在G1期及侵襲能力降低[8-9]。因此本次實驗選擇了培養(yǎng)微氧組的DPSCs和常氧組的DPSCs來研究其中的差異，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過程中常氧組的細胞數(shù)量較密集，數(shù)量較多，微氧各個組的細胞相對數(shù)量較少，常氧環(huán)境中生長的DPSCs吸光度值更高，進一步研究細胞PCNA蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)常氧組的目標蛋白表達較微氧組高，可以明顯促進DPSCs的增殖，而微氧組DPSCs增殖不明顯。由于細胞的增殖與分化受各種生長因子和其相應的受體組成的精密有序的信號通路網(wǎng)控制，p38-MAPK通路在轉(zhuǎn)導細胞外信號通路中發(fā)揮著重要的作用，STAT3也廣泛表達于不同類型的細胞和組織中，參與細胞生長，凋亡等功能的調(diào)控。因此我們采取抑制p38-MAPK通路和STAT3來進一步研究DPSCs的增殖和分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境為常氧且分別抑制p38-MAPK通路和STAT3時，p38-MAPK通路明顯抑制DPSCs的增殖，STAT3信號分子促進DPSCs的增殖；在微氧且抑制p38-MAPK通路和STAT3時，實驗結(jié)果與常氧環(huán)境竟然一致，由于STAT3是p38-MAPK的下游基因，研究結(jié)果提示p38-MAPK通路抑制可能激活STAT3信號分子，導致DPSCs的大量增殖，但是其中的具體分子機制并不清楚。在細胞的分化研究中，發(fā)現(xiàn)微氧組的細胞礦結(jié)節(jié)和更高的ALP表達，提示在微氧環(huán)境下DPSCs的分化能力更強，更能促進牙齒硬組織的形成。Lennon等[10]認為大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞在低氧條件下，成骨能力會增強，Grayson[11]表達了相似的觀點，這與本實驗的結(jié)果也一致。同時在微氧且抑制STAT3組顯示有大量的細胞礦結(jié)節(jié)和更高的ALP表達，常氧且抑制p38-MAPK組的細胞礦化結(jié)節(jié)較少，且細胞數(shù)量也較少，ALP表達，而且微氧組抑制STAT3組的相對比值明顯高于其它組，證明mRNA表達多，即ALP表達情況較高，提示p38-MAPK通路在常氧和微氧環(huán)境下對DPSCs分化都起到促進作用，STAT3信號分子在常氧和微氧環(huán)境下對DPSCs分化都起到抑制作用。

綜上所述，DPSCs在微氧環(huán)境下的增殖效果較差，但是分化能力更強，更能促進牙齒硬組織的形成，而且p38-MAPK通路抑制DPSCs的增殖，對DPSCs分化起到促進作用，STAT3信號分子促進DPSCs的增殖，對DPSCs分化起到抑制作用，對于p38-MAPK通路和STAT3信號分子之間在DPSCs的增殖和分化中的協(xié)同作用將進一步研究。