王巧云 姑麗米日·依馬木 林成

牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是一類具有間充質(zhì)特性的干細胞，有著良好的增殖和分化能力，其被證實能夠參與多種的組織修復(fù)，同時利用其制作的細胞聚合體結(jié)構(gòu)也能夠在大動物的神經(jīng)修復(fù)中產(chǎn)生良好的治療效果[1]。然而，DPSCs促進組織修復(fù)再生的機制尚不是十分的清楚。外泌體(EXO)是一類直徑約為20～100 nm的由細胞分泌的球狀囊泡，其中還有多種的物質(zhì)，能夠有效的進行細胞之間的物質(zhì)交換和信息傳導(dǎo)[2-3]。巨噬細胞在炎癥環(huán)境及組織再生調(diào)控中扮演著重要的角色，目前的研究表明，其兩種亞型分別起到促炎(M1)和抗炎(M2)的作用，能否實現(xiàn)促進巨噬細胞的極化由促炎的M1型向抗炎的M2型轉(zhuǎn)化，對于實現(xiàn)調(diào)控組織再生顯得尤為重要[4-6]。本實驗旨在研究大鼠rDPSCs分泌的EXO在體內(nèi)外對于巨噬細胞極化的影響，為進一步實現(xiàn)組織的再生調(diào)控提供支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)液、谷氨酰胺、青鏈霉素(Gibco,美國)；I型膠原酶、PKH-67熒光染料、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、胰島素、維生素C、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、茜素紅、油紅O、吲哚美辛、Hoechst 33342(Sigma，美國)；胎牛血清(FBS)(四季青)；左旋谷酰胺、2-巰基乙醇(Invitrogen，美國)；RAW264.7巨噬細胞株(ATCC，美國)；外泌體分離提取試劑盒(System Bioscience,美國)；蛋白提取定量試劑盒、Western Blot發(fā)光液、AlexaFlour 488、AlexaFlour 594熒光二抗、超速離心機、CO2恒溫孵箱(Thermo,美國)；Trizol試劑、Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(TakaRa,日本)；抗大鼠CD63、CD81及抗小鼠CD68、CD206抗體(Abcam,美國)；皮膚修復(fù)透明敷料(3M，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化)；倒置相差顯微鏡系統(tǒng)(Nikon，日本)；激光共聚焦顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus,日本)；透射電鏡(Hitachi-4800，日本)；流式細胞儀(Beckman Coulter,美國)；凝膠電泳成像拍照系統(tǒng)(上海Tanon有限公司)。

1.2 大鼠皮膚缺損模型的建立

取12 周齡SPF級雌性SD大鼠12 只，體質(zhì)量180～220 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，用于皮膚缺損模型建立及觀察治療，動物實驗程序符合新疆醫(yī)科大學(xué)的動物使用管理條例及相關(guān)倫理標準。將SD大鼠隨機分為2 組(n=6): PBS溶液對照組、EXO懸液治療組。具體的操作步驟為：將大鼠稱重后，采用腹腔麻醉，取俯臥位固定于手術(shù)操作臺上，背部中央常規(guī)備皮消毒后，切取直徑為2 cm的全層皮膚，然后分別在其表面涂布PBS溶液、EXO懸液后，利用3M皮膚敷料固定創(chuàng)面。最后采用荷包縫合術(shù)將模型區(qū)域固定，14 d后取材檢測。

1.3 rDPSCs的分離與培養(yǎng)

利用脫頸法處死大鼠后，將其置于75%無水乙醇當中，5 min后取出置于超凈工作臺當中，然后取出其下頜骨。用無菌的含有雙抗(青-鏈霉素)PBS溶液對組織進行清洗，然后在浸潤的PBS中剝離頜骨表面的肌肉和結(jié)締組織，并沿著下頜骨下緣去除骨組織，待暴露下頜牙之后，建立牙髓通道，然后小心將牙髓從根管中取出。用無菌齒鑷將牙髓組織分離成小塊(1 mm3)后，放入含有I型膠原酶的離心管中，37 ℃孵箱中消化40 min。收集細胞懸液，利用70 μm的濾器濾過后，加入到六孔板中(含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液)，在37 ℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，每3天換液1 次，待2 周后單克隆達到融合后常規(guī)傳代使用。

1.4 rDPSCs的細胞表型鑒定

取處于生長對數(shù)期的P3代rDPSCs,經(jīng)過細胞消化離心收集后，用PBS制備密度為1×106/ml的單細胞懸液，分裝為不同離心管后，用抗大鼠CD14-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE室溫下避光孵育30 min, 然后用PBS溶液洗滌3 次后，重懸于200 μl的PBS溶液中。最后利用流式細胞儀檢測細胞表面標志分子的陽性比率。

1.5 rDPSCs的成骨成脂、能力檢測

將rDPSCs以1.5×105細胞/孔，接種于12 孔板當中，分別進行成骨和成脂誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)液采用含有以下物質(zhì)的α-MEM培養(yǎng)液：100 ml/L胎牛血清、 200 μmol/ml吲哚美辛、 0.5 mmol/ml IBMX、 10 μg/ml胰島素、 1 μmol/L 地塞米松。成脂誘導(dǎo)液采用含有以下物質(zhì)的α-MEM培養(yǎng)液：100 ml/L胎牛血清、5 mmol/L β-甘油磷酸鈉、 100 nmol/L地塞米松、50 μg/ml維生素C。成骨誘導(dǎo)14 d后，用4%多聚甲醛溶液固定，10 g/L茜素紅染色約10 min。利用PBS溶液清洗3 次后，觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成情況，并進行拍照。成脂誘導(dǎo)14 d后，用4%多聚甲醛溶液固定，以油紅O異丙醇溶液染色約30 min，PBS溶液清洗3 次后，顯微鏡下觀察脂滴的形成情況，并進行拍照。

1.6 EXO的提取及鑒定

將第3 代的rDPSCs以5×105個/75 cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，將用于rDPSCs培養(yǎng)的胎牛血清在100 000 g/min的條件下預(yù)先離心，去除其中的EXO，并配制不含有外泌體的條件培養(yǎng)液。加入10 ml條件培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)3 d后收集培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液以1 000 g/min的速度離心10 min，去除細胞殘渣和雜質(zhì)，吸取上清液，按每1 ml培養(yǎng)液加入200 μl的EXO提取試劑進行充分混勻，4 ℃孵育過夜后，以3 000 g/min離心30 min，沉淀即為EXO。加入200 μl PBS溶液重懸沉淀，然后-20 ℃保存?zhèn)溆?。利用透射電鏡觀察并拍照，Western blot檢測其表面抗原標志物表達。

取20 μl PBS重懸的EXO溶液，然后取懸浮液滴入富有支持膜的銅網(wǎng)上，待液體揮發(fā)后即可利用透射電子顯微鏡進行觀察。將溶于PBS的EXO上樣，經(jīng)SDS-PAGE蛋白分離，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，2 h之后，用60 g/L的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，然后分別用CD63(1∶200)、 CD81(1∶200)的抗體4 ℃孵育過夜，TBST液洗膜3 次，每次5 min，然后分別加入山羊抗小鼠(CD63)及山羊抗兔(CD81)IgG(1∶2 000)二抗，室溫下孵育1 h，再次TBST液洗膜3 次，每次5 min。Tanon凝膠成像系統(tǒng)進行圖像掃描和分析。

1.7 細胞免疫熒光染色

將細胞樣本進行固定后，用PBS溶液清洗3 次，然后用5%BSA室溫下封閉1 h，之后用抗CD68(1∶400)、CD206(1∶200)的一抗室溫下孵育2 h，然后用PBS溶液清洗3 次，分別用抗羊(CD68)和抗兔(CD206)的AlexaFlour 488、AlexaFlour 594熒光二抗(1∶200)室溫下孵育30 min，然后PBS溶液清洗3 次。最后用Hoechst 33342染料復(fù)染細胞核5 min，清洗后80%甘油溶液封閉觀察后拍照。

按照說明書的方法用PKH-67熒光染料對EXO進行標記染色，然后以200 μg的總量加入到預(yù)先鋪好細胞的孔板中，4 h之后用4%多聚甲醛溶液進行固定10 min，然后PBS溶液清洗3次。之后按照之前的方法,利用抗CD68一抗及對應(yīng)的熒光二抗對細胞進行染色。PBS溶液清洗3 次后，利用Hoechst 33342染料復(fù)染細胞核5 min, 最后利用PBS溶液清洗3 次，80%甘油封閉觀察后拍照。

1.8 實時熒光定量核酸擴增檢測

取正常及成骨成脂誘導(dǎo)7 d之后的細胞、正常對照及加入rDPSCs來源的EXO 3 d后的巨噬細胞和正常對照及皮膚缺損治療后14 d的皮膚組織，PBS溶液清洗之后利用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量檢測核酸擴增?；?qū)?yīng)的引物序列見表 1。

表 1 RT-qPCR引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有原始數(shù)據(jù)進行分析前均經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性的檢驗，分別用t檢驗和方差分析檢驗2 組或多組之間的差異是否具有顯著性，同時在多組之間進行比較，利用Bonferroni法記性P值的矯正，P<0.05時,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rDPSCs的鑒定及多向分化潛能驗證

經(jīng)過流式細胞術(shù)檢測，rDPSCs陽性表達CD90、CD105、CD146，陰性表達CD14、CD34、CD45，其結(jié)果說明rDPSCs均具有間充質(zhì)特有表型，同時不表達造血系表型(圖 1A)。分別通過成骨、成脂誘導(dǎo)7 d后，qPCR檢測ALP和Runx2等成骨相關(guān)基因，PPARγ和LPL等成脂相關(guān)基因，可以看到誘導(dǎo)組相對對照組而言，表達量明顯增加(P<0.05)(圖 1B)。誘導(dǎo)14 d后，可以看出均可以染出茜素紅和油紅O陽性，證明rDPSCs具有多向分化潛能(圖 1C)。

2.2 rDPSCs分泌的EXO的鑒定

經(jīng)過EXO提取試劑盒收集到的白色沉淀，溶于PBS溶液后進行透射電鏡的觀察，可觀察到其為50～100 nm的囊泡結(jié)構(gòu)(圖 2A)。同時，經(jīng)過Western blot檢測其CD63和CD81的蛋白表達水平，結(jié)果也顯示樣本相對于細胞強陽性表達2 種蛋白(圖 2B)。

2.3 EXO對于巨噬細胞極化的作用

加入外源性的EXO之后，通過免疫熒光共染可以看出，相對于對照組加入的PBS溶液，EXO可以顯著的促進巨噬細胞表達CD206分子，提高其向M2型極化的比例(圖 3A)。同時在加入EXO 3 d后，相對于對照組，M1極化的相關(guān)分子(TNF-α、iNOS)的基因表達均下降(P<0.05)，而相反的是，M2極化的相關(guān)分子(IL-4、IL-10、Arg-1)的基因表達均顯著上升(P<0.01)(圖 3B)。此部分結(jié)果證明，在體外環(huán)境中，rDPSCs來源的EXO能夠有效的促進巨噬細胞表達向M2型極化的相關(guān)分子，并且提高其向M2型極化的細胞比例。

A：流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物；B：形態(tài)及成骨成脂染色；C：rDPSCs的ALP、Runx2、PPAR-γ、LPL的mRNA表達

A：透射電鏡觀察；B：Western blot顯示CD63和CD81

2.4 EXO對于皮膚創(chuàng)傷愈合中巨噬細胞極化的影響

皮膚缺損治療14 d后進行皮膚取材。通過qPCR檢測巨噬細胞極化的相關(guān)分子的基因表達水平可以觀察到，與M1型極化的相關(guān)炎癥因子TNF-α、TNF-1β、IL-6的表達水平均下降(P<0.05)，其中IL-6最為顯著(P<0.01)(圖 4A)。與此同時，與M2型極化的相關(guān)分子表達均有顯著的升高(P<0.01)(圖 4B)。此部分證明，在皮膚缺損后的愈合再生過程中，EXO通過提高M2型相關(guān)分子IL-4、IL-10、IL-13的表達水平，同時抑制M1型相關(guān)炎癥因子的表達水平，有效的提高M2型巨噬細胞的極化比例，從而更好地調(diào)控炎癥微環(huán)境，促進局部組織的修復(fù)再生。

3 討 論

組織再生一直都是醫(yī)學(xué)中重點關(guān)注的科學(xué)問題，如何通過有效的調(diào)控促進組織再生是研究者們的長期訴求。間充質(zhì)干細胞的應(yīng)用已經(jīng)被證明能夠在多種的疾病和再生中產(chǎn)生療效，然而其機制仍然不是十分明確。早期的研究表明，外源性移植的間充質(zhì)干細胞能夠在宿主體內(nèi)直接分化成多種類型的體細胞，同時其具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，但是其真正發(fā)揮作用的細胞數(shù)量卻小于1%[7-9]。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞治療的過程中，旁分泌發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，近期的研究熱點證實其主要為EXO[10-11]。然而間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體能夠調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境的機制尚不清楚。EXO內(nèi)部含有豐富的蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)，促進細胞和組織間的信息交流，其可以發(fā)揮多種的生物學(xué)功能[12]。本實驗通過提取并鑒定rDPSCs分泌的EXO，發(fā)現(xiàn)其能夠有效地促進巨噬細胞的極化，并提高其向利于組織再生的M2型的比例，豐富EXO的應(yīng)用前景。本實驗尚未揭示EXO具體是通過何種信號分子產(chǎn)生的促進巨噬細胞極化的作用的。因此，未來下一步研究中將聚焦rDPSCs來源的EXO促進巨噬細胞極化的具體分子機制上，為解釋其單獨的生物活性功能提供有力支撐。

圖 4 皮膚創(chuàng)傷愈合過程中EXO對于巨噬細胞極化的影響(*: vs PBS組，P<0.05;**: vs PBS組，P<0.01)