鄭慶紅,李晶,吉姣姣,李建寬,2,高建平,2*

(1.山西醫(yī)科大學 藥學院,山西 太原 030001;2.山西省道地藥材資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心,山西 太原 030001)

0 引言

黨參(Codonopsis Radix)為桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.、素花黨參C.pilosulaNannf. Var.modesta(Nannf.) L. T. Shen或川黨參C.tangshenOliv.的干燥根,具有健脾益肺,養(yǎng)血生津等功效,是我國傳統(tǒng)的補氣藥(《中國藥典》2015版)?，F(xiàn)代藥理研究表明黨參有效成分黨參多糖具有增加紅細胞含量,增強淋巴細胞免疫作用[1],治療慢性阻塞性肺疾病[2],保護胃黏膜、抗胃潰瘍[3]等功效。

蔗糖是植物多糖合成途徑中重要的前體物質(zhì)[4],其合成主要由植物“源端”,即葉組織經(jīng)光合作用完成,然后裝載入韌皮部的篩管伴胞復(fù)合體,通過共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑到達花、果實、根系等“庫”器官[5-6]。在缺少胞間連絲的情況下,植物體中蔗糖由“源”到“庫”的運輸主要通過韌皮部質(zhì)外體途徑進行[7],在質(zhì)外體途徑中存在一種關(guān)鍵性的載體蛋白,即蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白(sucrose/H+cotransporter,SUC或sucrose transporter,SUT),其可利用ATP在質(zhì)膜H+/ATPase所建立的質(zhì)子動力勢作用下產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度,使蔗糖與H+跨膜共轉(zhuǎn)運[8-9]。

雙子葉植物中蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白分為SUT1、SUT2、SUT4這3個亞族,均屬寡聚糖/H+共轉(zhuǎn)運家族[10]。SUT1亞族為雙子葉植物所特有,主要定位于韌皮部篩分子細胞質(zhì)膜或庫組織的細胞質(zhì)膜上,在源庫組織中均有表達,主要參與蔗糖的裝載和卸載[11-12]。SUT2亞族屬于低親和力-高轉(zhuǎn)運能力的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白,多不具有轉(zhuǎn)運蔗糖的活性,且不能有效定位到質(zhì)膜[13],牡丹PsSUT2基因主要在庫組織,如根、老莖、葉、鱗芽(花瓣)中表達,尤以盛花期花瓣中表達量最高[7]。SUT4亞族屬于低親和-高轉(zhuǎn)運能力的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白,在蔗糖較高的條件下,能以較大速率跨膜轉(zhuǎn)運蔗糖分子[14]。植物SUT4類蛋白主要參與調(diào)控蔗糖在細胞液泡中的積累。擬南芥中AtSUC4基因超量表達后葉片蔗糖含量降低,與AtSUC4促進液泡中蔗糖外排的作用相一致[15];煙草NtSUT4的超量表達可促進纖維素的合成[16],蘋果MdSUT4定位于蘋果愈傷組織原生質(zhì)體的液泡膜上,在各組織中均有較高表達,且在果實發(fā)育中的表達水平與蔗糖含量呈負相關(guān),過表達MdSUT4能降低蔗糖含量,提高類黃酮含量[10],推測其可能參與蔗糖從液泡膜中的外排。但關(guān)于黨參中SUT4類蛋白的研究,目前尚未見報道。

鑒于蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白在糖生理中的重要作用,推測黨參蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因可能在黨參多糖代謝與調(diào)控中起重要作用。本文以陵川潞黨參為試材,克隆黨參蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因CpSUC4,進行生物信息學及原核表達分析,并通過基因組織表達模式分析,結(jié)合黨參多糖含量分析,探討其與黨參多糖代謝的相關(guān)性,為進一步揭示其在黨參多糖合成中的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自山西陵川,經(jīng)山西醫(yī)科大學藥學院高建平教授鑒定為黨參,于盛花期取黨參根、莖、葉、花組織樣品,液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CpSUC4基因全長cDNA的克隆

采用改良Trizol法提取黨參根、莖、葉、花四組織總RNA[16],質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。cDNA第一鏈合成按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Nr功能注釋為SUC4的Unigene序列,利用Primer5.0設(shè)計引物,以黨參根系cDNA為模板,進行PCR擴增,上下游引物序列見表1。

PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后,采用膠回收試劑盒對目標片段進行回收,并連接至pMDTM18-T載體(Takara,Japan),重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,陽性重組質(zhì)粒進行雙向測序(北京六合華大基因科技股份有限公司)。

表1 試驗所用引物序列

1.3 黨參CpSUC4基因生物信息學分析

根據(jù)測序得到的黨參CpSUC4基因cDNA序列,進行蛋白質(zhì)和核苷酸數(shù)據(jù)庫Blast搜索(NCBI:http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/),采用“ORF Finder”查找開放閱讀框(open reading frame,ORF,http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、蛋白跨膜區(qū)預(yù)測、亞細胞定位預(yù)測、氨基酸序列相似性分析等均為在線分析,具體方法參照課題組前期研究[17]。

利用DNAMAN6.0軟件進行氨基酸多重序列比對。通過MEGA5.1重建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹,設(shè)置Bootstrap=1000。

1.4 黨參CpSUC4基因的原核表達

根據(jù)測序所得CpSUC4基因序列設(shè)計帶酶切位點的特異引物,擴增CpSUC4基因完整cDNA序列,引物序列見表1。

將純化的PCR產(chǎn)物與pET-28a(+)分別進行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切,T4DNA ligase連接,熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含100 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上,挑取陽性克隆,搖菌,提取質(zhì)粒并酶切鑒定,獲得重組質(zhì)粒pET-28a-CpSUC4。轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pET-28a-CpSUC4至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,以pET-28a空載體為對照。具體方法見文獻[18]。

1.5 黨參多糖含量測定

于黨參盛花期分別取根、莖、葉、花四組織樣品,低溫(<60℃)烘干后,粉碎,進行多糖含量測定。多糖含量測定方法參照課題組前期研究[19]。

1.6 黨參CpSUC4基因不同組織表達分析

以黨參GAPDH基因為內(nèi)參基因,采用qRT-PCR進行黨參CpSUC4基因的組織表達模式分析。試驗方法見文獻[4]。qRT-PCR引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參CpSUC4基因全長克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中Nr注釋為SUC4的Unigene序列,設(shè)計特異引物,擴增產(chǎn)生長度約為1 600 bp的片段(圖1),測序獲得1 832 bp的序列,該cDNA序列包含的開放閱讀框(ORF)常1 488 bp,編碼495個氨基酸,BLASTx分析表明其與多個物種中SUT相似性很高,可達74%～77%,因此將其定名為CpSUC4。

M-marker 1-CpSUC4gene M-DNA marker 1-CpSUC4基因Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of the full length of the CpSUC4gene圖1 黨參CpSUC4基因全長cDNA電泳分析

2.2 黨參CpSUC4生物信息學分析

NCBI中CpSUC4氨基酸序列Blast結(jié)果顯示其與向日葵(Helianthusannuus)SUC4相似性達77%,與中?？Х菴offeacanephora、番茄(Lycopersiconesculentum)、北美假大麻(Datiscaglomerata)等的SUC4相似性達75%,并利用DNAMAN6.0軟件對CpSUC4和其它物種的SUC4進行氨基酸序列的多重比對分析,結(jié)果表明CpSUC4與已知SUC4蛋白的氨基酸序列高度保守,相似性平均為73.35%,其中僅有5′端氨基酸序列同源性較低,第28-88位、第409-464位氨基酸序列高度一致(圖2)。

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示CpSUC4蛋白含有一個MFS(Major facilitator superfamily)功能域,屬于GPH超家族(GPH family sucrose/H+symporter)和MFS蛋白家族,具備高等植物蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的典型結(jié)構(gòu)域特征(圖3)。

Fig.2 Multiple alignment of the CpSUC4 deduced amino acid sequence with SUC4 in other plants圖2 黨參CpSUC4與其他植物SUC4氨基酸序列比對

Fig.3 Prediction of the conserved region of the CpSUC4deduced amino acid sequence圖3 黨參CpSUC4氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析

為分析黨參CpSUC4基因所編碼蛋白的進化關(guān)系,從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取不同科共19個物種的SUT/SUC氨基酸序列,構(gòu)建黨參CpSUC4蛋白系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示,黨參CpSUC4與菊科植物向日葵、萵苣、菊苣蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白親緣關(guān)系較近,可聚為一支(圖4)。

Fig.4 Clustering tree of SUC4s in plants圖4 植物SUC4聚類樹

亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位系數(shù)為0.850,過氧化物酶體定位系數(shù)為0.539,細胞質(zhì)膜定位系數(shù)為0.440,線粒體內(nèi)膜定位系數(shù)為0.100,說明CpSUC4蛋白主要定位在膜結(jié)構(gòu)上,這與其主要參與蔗糖-質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)運一致。TMHMM Server v.2.0跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖5)表明,CpSUC4蛋白含有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白所具有的典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)域(33-55位、65-87位、100-119位、134-153位、174-196位、221-240位、276-298位、321-343位、356-375位、390-412位、424-446位、461-483位氨基酸),N-端和C-端均位于細胞質(zhì)的一側(cè)。

Fig.5 Prediction of transmembrane domain of CpSUC4 protein圖5 CpSUC4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)黨參CpSUC4分子式為C2487H3833N637O654S22,總原子數(shù)為7633。相對分子質(zhì)量為53.83 kDa;理論等電點(pI)為8.55,帶正電殘基(Arg+Lys)為34,帶負電殘基(Asp+Glu)為30。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為38.70,表明該蛋白質(zhì)穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為107.74,親水性系數(shù)為0.556。

2.3 黨參CpSUC4基因表達與黨參多糖合成相關(guān)性分析

為了分析黨參CpSUC4基因表達與黨參多糖合成的相關(guān)性,對黨參不同組織黨參多糖含量及CpSUC4基因表達量進行了測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黨參根系中多糖含量顯著高于其他組織(P<0.05),花次之,葉中多糖含量最低,各組織間多糖含量差異顯著(P<0.05)。而基因表達分析顯示,黨參根和花中CpSUC4基因表達量最高,二者差異不顯著(P<0.05),而莖和葉中基因表達量最低,顯著低于花中基因表達量(P<0.05)(圖6)。

Fig.6 Analysis of the polysaccharide content (A) and the CpSUC4 gene expression (B) in Codonopsispilosula Data represent the means ± SD from three independent experiments. Statistically significant differences between means were determined using Fisher’s LSD test (P<0.05)圖6 黨參不同組織多糖含量(A)及CpSUC4基因表達(B)分析不同小寫字母表示0.05水平差異顯著

2.4 黨參CpSUC4基因原核表達分析

為了分析CpSUC4基因是否能夠編碼活性蛋白,構(gòu)建pET-28a-CpSUC4原核重組表達載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后進行IPTG誘導表達,結(jié)果顯示重組CpSUC4表達載體可表達產(chǎn)生相對分子質(zhì)量約為60 kDa特異性融合蛋白,而對照(不帶外源基因的載體pET-28a)則不表達該蛋白(圖7)。

M-Marker;1-含pET-28a的菌未誘導;2-含pET-28a的菌誘導; 3-含pET-28a-CpSUC4的菌未誘導;4-含pET-28a-CpSUC4的菌誘導M-Marker; 1-pET-28a without induction; 2-pET-28a induced; 3-pET-28a-CpSUC4 without induction; 4-pET-28a-CpSUC4inducedFig.7 SDS-PAGE analysis of pET-28a-CpSUC4 expressed products圖7 pET-28a-CpSUC4重組表達蛋白的SDS-PAGE分析

3 討論

黨參為中國傳統(tǒng)補氣藥,而黨參多糖作為黨參有效成分之一,具有多種藥理活性,因此通過分子水平研究其生物合成機制具有重要意義。本文根據(jù)克隆得到的黨參SUC4基因序列,進行核苷酸和預(yù)測氨基酸序列分析,結(jié)果顯示CpSUC4與其他植物SUC4具有很高的相似性,CpSUC4具有SUC/SUT所共有的MFS功能域,而MFS超家族常含有12個高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)域,只在N端和C端存在高變異區(qū),最保守的跨膜區(qū)域位于第1、2和11跨膜區(qū)[6],而CpSUC4氨基酸序列高度一致的區(qū)域位于第28～88位、409～464位氨基酸,分別位于第1(33～55位)、2(65～87位)、11(424～446位)跨膜區(qū)。由于蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因在高等植物中具有高度保守性,親緣關(guān)系越近,蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的功能越相似[20]。黨參薄壁細胞中含有大量菊糖[21],其為菊科植物特征性成分,有研究者推測其與菊科有親緣關(guān)系,本試驗系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)CpSUC4與菊科向日葵、菊苣、萵苣等SUC/SUT親緣關(guān)系最近,這也為進一步研究菊科與桔?？频挠H緣關(guān)系提供了理論依據(jù)。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測CpSUC4大小為53.83 kDa,而原核表達分析顯示CpSUC4融合表達蛋白大小為60kDa左右,與預(yù)測目標大小基本一致。

亞細胞定位預(yù)測顯示CpSUC4屬于液泡膜蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白,為植物所特有的載體蛋白,主要在蔗糖進出韌皮部和庫器官、蔗糖的供給與貯藏、轉(zhuǎn)運與調(diào)控等生理過程中發(fā)揮重要作用[10]。擬南芥中AtSUC4定位于液泡膜,參與液泡膜蔗糖的外運[13],同樣,桃液泡膜PpSUT4也參與蔗糖從液泡中的外排[21],因此推測黨參CpSUC4可能參與蔗糖從液泡中的外排。

CpSUC4基因在黨參根、莖、葉、花中均有表達,說明CpSUC4基因可能具有雙重功能,即韌皮部蔗糖的卸載及裝載。杏PaSUC4基因同樣在源庫組織中均表達,但是在源器官如成齡葉、新梢中表達量最高[22],趙婷婷[23]對甘蔗的SUC4進行了定量分析,結(jié)果是在葉中表達量最高,在根中最低。本文的研究結(jié)果表明,CpSUC4在“源”器官葉中表達量最低,顯著低于“庫”器官花,推測CpSUC4主要參與“庫”器官韌皮部蔗糖的卸載。

本課題組及以往研究顯示,黨參多糖合成的前體物質(zhì)包括葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖等單糖,而這些單糖尤其是葡萄糖和果糖主要由蔗糖分解產(chǎn)生[4],因此蔗糖的代謝活動是黨參多糖及其他以蔗糖為前體物質(zhì)的有效成分合成的主要影響因子之一。蘋果MdSUT4的超量表達可能促進蔗糖從液泡中外排至細胞質(zhì)中,為類黃酮的合成提供了大量的前體物質(zhì),從而促進了類黃酮的合成,而降低了蔗糖含量[10]。多糖類物質(zhì)如果聚糖主要在液泡中合成,且果聚糖合成關(guān)鍵酶如1-SST、1-FEH等均定位于液泡中[24],而蔗糖的外排會導致多糖合成前體物質(zhì)的減少,從而降低多糖含量。本試驗表明:盛花期黨參多糖在根系中含量顯著高于其他組織,而CpSUC4基因表達量在“源”器官葉中表達量最低,而蔗糖的代謝活動主要在細胞質(zhì)中進行[25],因此推測CpSUC4表達量高,則會促進蔗糖向“庫”器官如根、花等組織運輸,而CpSUC4的液泡外排作用會使得韌皮部細胞質(zhì)中蔗糖的大量積累,從而促進多糖合成,這也正與黨參根、花等“庫”器官多糖含量顯著高于葉等“源”器官相符合。鑒于黨參因此通過黨參CpSUC4在糖類物質(zhì)代謝及運輸過程中的重要性,本文CpSUC4基因的克隆,可為進一步研究其在黨參多糖生物合成中的調(diào)控機制提供物質(zhì)基礎(chǔ),為完善黨參多糖代謝途徑奠定理論基礎(chǔ)。