劉澤燁,薄濤,許靜,王偉

(山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實驗室,山西 太原,030006)

0 引言

金屬硫蛋白(Metallothionein)富含半胱氨酸[1],是動物、植物和微生物中廣泛存在的一類小分子蛋白[2],通過巰基與金屬離子相互作用[3],具有螯合金屬離子能力。根據(jù)氨基酸序列、半胱氨酸殘基分布和序列相似性,可將金屬硫蛋白分為15個家族[4]。金屬硫蛋白具有重金屬解毒[5],調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)[6]和活性氧清除[7]的功能。金屬硫蛋白高級結(jié)構(gòu)呈無序狀態(tài);與金屬離子結(jié)合后,會折疊為有序結(jié)構(gòu)[8]。

金屬硫蛋白氨基酸序列在高等真核生物中具有較高的保守性,但在其他生物中,其氨基酸序列存在較大差異。目前對金屬硫蛋白的研究主要集中在高等真核生物和原生動物中,如哺乳類、甲殼類、植物[5]、原生生物四膜蟲[9]等。而關(guān)于藻類金屬硫蛋白以及對藻類重金屬離子解毒機(jī)制的相關(guān)研究較少[10]。藻類作為水體中的初級生產(chǎn)者,分布范圍廣,適應(yīng)性強(qiáng),在水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中占有十分重要的地位[11]。藻類常被用來進(jìn)行水環(huán)境檢測、水體生態(tài)修復(fù)和治理[12]。金藻(Poterioochromonasmalhamensis)是一種廣泛分布的淡水藻類,在淡水環(huán)境中是細(xì)菌和浮游藻類的捕食者;當(dāng)環(huán)境中缺少餌料生物時,它亦能夠以光合自養(yǎng)方式進(jìn)行生長和繁殖[13]。

本研究首次從金藻中鑒定了一種新的PmCRP1基因,分析了PmCRP1基因?qū)饘匐x子的響應(yīng);構(gòu)建重組質(zhì)粒pSUMO-PmCRP1,獲得PmCRP1的原核重組表達(dá);表明重組PmCRP1的大腸桿菌金屬提高了對離子耐受性,PmCRP1可能為一類新型的金屬硫蛋白。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒

金藻由中科院水生生物研究所龔迎春博士惠贈。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和BL21(DE3)為本實驗室保存,pE-SUMO原核表達(dá)載體為本實驗室保存,pMD18-T載體購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試劑

Taq DNA Polymerace，T4 DNA 連接酶，限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ，XhoⅠ(Thermo Scientific公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒(北京天根生化公司)；蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉和瓊脂粉(生工生物工程股份有限公司)；引物合成(生工生物工程股份有限公司)。

1.3 金藻細(xì)胞培養(yǎng)

藻種培養(yǎng)用AF-6培養(yǎng)基,培養(yǎng)基組成參考宋立榮等[13],培養(yǎng)溫度20 ℃,光照強(qiáng)度約100 μmol·m-2·s-1。

1.4 PmCRP1基因的鑒定及表達(dá)分析

以金藻基因組為模板,擴(kuò)增PmCRP1基因(引物見表1)。將在AF-6培養(yǎng)基中生長的金藻用Tris-HCl清洗兩次,并在Tris-HCl中繼續(xù)培養(yǎng)36 h。分別用1 μg/mL的Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Hg2+誘導(dǎo)4 h,Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板,進(jìn)行qRT-PCR分析。PmCRP1基因和18srRNA內(nèi)參基因的引物見表1。每個樣本取3個平行,結(jié)果通過StepOne Software 軟件讀取及采用相對CT 法處理分析。統(tǒng)計方法采用t檢驗,P<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列

1.5 PmCRP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增的PmCRP1基因與pMD-18T載體連接,獲得pMD-18T-PmCRP1重組質(zhì)粒。將pMD-18T-PmCRP1與pE-SUMO質(zhì)粒用BamH Ⅰ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物PmCRP1與pE-SUMO連接，獲得重組質(zhì)粒pSUMO-PmCRP1。經(jīng)PCR和雙酶切初步鑒定后，上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.6 SUMO-PmCRP1融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和Western blotting分析

將重組質(zhì)粒pSUMO-PmCRP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,大腸桿菌BL21/pSUMO-PmCRP1菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,0.05 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，10 000 r/min，4℃離心5 min收集菌株，將菌株重懸于1 × PBS緩沖液中，超聲破碎儀破碎菌體，收集全菌液和上清液，12% SDS-PAGE電泳分析。蛋白樣品12% SDS-PAGE電泳后, 100 V，35 min轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%的脫脂奶粉封閉1 h，鼠源Anti-His(1∶500稀釋)4℃過夜孵育，羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)作二抗，室溫下?lián)u床孵育1 h，避光顯影。

1.7 重組大腸桿菌BL21/pSUMO-PmCRP1金屬離子耐受性分析

大腸桿菌菌株BL21/pSUMO和BL21/pSUMO-PmCRP1,分別在含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6后,加入0.05 mmol/L IPTG,180 rpm，37℃誘導(dǎo)5 h。分別將上述兩種重組大腸桿菌轉(zhuǎn)移至新的含有50 μg/mL卡那霉素5 mL LB培養(yǎng)基中,使其終濃度為OD600=0.2,并分別加入不同濃度的CuSO4,CdCl2或ZnSO4, Cu2+濃度為0、1、2、3、4、5、6、8、10 mmol/L;Cd2+和Zn2+為0、100、200、300、400、500、600、700、800、1 000 μmol/L,37 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)5 h。10 000 r/min,4℃離心1 min收集1 mL菌液,去上清,用1 mL的無菌超純水重懸菌株。用分光光度計法,測定不同金屬離子濃度下,重組大腸桿菌的生長曲線。每組實驗重復(fù)3次,統(tǒng)計方法采用t檢驗,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。TeMTT2可以顯著提高大腸桿菌BL21/pSUMO-TeMTT2對Cd2+的耐受性[14]。將大腸桿菌BL21/pSUMO、BL21/pSUMO-TeMTT2和BL21/pSUMO-PmCRP1分別在含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6, 0.05 mmol/L IPTG,180 rpm,37℃誘導(dǎo)4 h。分別將上述三種重組大腸桿菌轉(zhuǎn)移至新的含有50 μg/mL卡那霉素5 mL LB培養(yǎng)基中,使其終濃度為OD600=2.0,在含有200 μmol/L CdCl2的LB固體培養(yǎng)基上劃線,37℃孵育24 h。

2 實驗結(jié)果

2.1 PmCRP1基因鑒定及PmCRP1蛋白序列分析

以金藻基因組為模板,擴(kuò)增獲得PmCRP1基因(396 bp)(圖1A)。通過ProtParam在線工具(http:∥web.expasy.org/protparam)對PmCRP1蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行分析。PmCRP1全長131個氨基酸(圖1B),分子質(zhì)量14.28 kD,等電點(diǎn)5.02。PmCRP1與金屬離子結(jié)合相關(guān)氨基酸29個,其中Cys 26個, His 3個,Cys占整個蛋白質(zhì)的19.85 %。不同金屬硫蛋白家族中,對極性帶電荷氨基酸Lys和Arg,與極性不帶電荷氨基酸Ser和Thr的偏愛性不同。在PmCRP1中,有9個Lys,不含Arg;以及含有7個Ser和2個Thr。PmCRP1具有與金屬硫蛋白家族類似的半胱氨酸基序,其中含有1個CCC、1個CXCC、2個XCCX、2個CXC和7個XXCXX半胱氨酸基序(圖1C)。通過SignalP在線工具(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對PmCRP1的信號肽序列進(jìn)行預(yù)測分析,結(jié)果顯示無信號肽。通過NCBI Blastp 在線比對工具對PmCRP1氨基酸序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果顯示,PmCRP1同源蛋白為未知的功能蛋白。PmCRP1富含半胱氨酸,無信號肽,具有典型的金屬硫蛋白半胱氨酸基序,可能具有金屬硫蛋白生物學(xué)功能。

A. PmCRP1基因鑒定,Mr為Trans 2K DNA Marker,1:以金藻基因組為模板的PmCRP1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; B. PmCRP1氨基酸序列,Cys殘基以紅色顯示;C. 不同金屬硫蛋白家族中,His殘基和Cys基序(其中X是任何氨基酸和C半胱氨酸殘基)的分布,灰色框表示存在于對應(yīng)金屬硫蛋白家族中, 白色框表示不存在,數(shù)字代表存在于PmCRP1中His殘基和Cys基序的個數(shù);Fig.1 Identification of PmCRP1 and sequence analysis of PmCRP1 protein圖1 PmCRP1基因的鑒定及PmCRP1蛋白的序列分析

2.2 金屬離子誘導(dǎo)對PmCRP1基因表達(dá)的影響

為了分析PmCRP1基因的功能,通過qRT-PCR分析金屬離子脅迫下該基因的表達(dá)水平。在不添加金屬離子的對照組中,PmCRP1基因表達(dá)量最高。在培養(yǎng)基中加入1 μg/mL Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Hg2+,PmCRP1基因表達(dá)量均顯著下降(圖2)。

qRT-PCR分析Cd2+,Cu2+,Zn2+,Pb2+,Hg2+(1 μg/mL)誘導(dǎo)下PmCRP1基因的表達(dá), 星號表明不同處理組之間存在顯著性差異,*P<0.05,**P<0.01, 每個樣本設(shè)有三個平行Fig.2 Expression analysis of PmCRP1 induced by different metal ions圖2 PmCRP1基因在不同金屬離子誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

2.3 pSUMO-PmCRP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

為了進(jìn)一步分析PmCRP1蛋白的功能,首先構(gòu)建了大腸桿菌pSUMO-PmCRP1重組質(zhì)粒,將PmCRP1基因連接到含有SUMO標(biāo)簽的原核表達(dá)載體上,構(gòu)建pSUMO-PmCRP1原核表達(dá)質(zhì)粒(圖3A)。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定(圖3B),測序結(jié)果表明pSUMO-PmCRP1表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.重組質(zhì)粒pSUMO-PmCRP1構(gòu)建示意圖;B.重組質(zhì)粒pSUMO-PmCRP1的鑒定, Mr為Trans 2K DNA Marker,1:pSUMO-PmCRP1質(zhì)粒,2:PmCRP1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 3:pSUMO-PmCRP1質(zhì)粒的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切產(chǎn)物Fig.3 Construction and identification of recombinant plasmid pSUMO-PmCRP1圖3 重組質(zhì)粒pSUMO-PmCRP1的構(gòu)建及鑒定

2.4 SUMO-PmCRP1融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

質(zhì)粒pSUMO和pSUMO-PmCRP1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后, IPTG誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)后產(chǎn)生20 kDa 左右的SUMO蛋白條帶和34 kDa的蛋白條帶,該蛋白的表達(dá)量占總蛋白的12.8%(圖4A)。誘導(dǎo)后的BL21/pSUMO-PmCRP1重組大腸桿菌裂解液經(jīng)Western blotting分析(圖4B),重組融合蛋白特異性地與Anti-His抗體反應(yīng)。結(jié)果表明,SUMO-His-PmCRP1獲得融合表達(dá)。

A. 融合蛋白SUMO-PmCRP1的表達(dá),M為ProteinRuler II, 1:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21/pSUMO重組大腸桿菌裂解液, 2:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21/pSUMO裂解液, 3:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21/pSUMO上清液, 4:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21/pSUMO-PmCRP1裂解液, 5:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21/pSUMO-PmCRP1裂解液, 6:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21/pSUMO-PmCRP1上清液; B. SUMO蛋白及融合蛋白SUMO-PmCRP1的Western blotting分析Fig.4 Expression analysis of fusion protein SUMO-PmCRP1 in Recombinant E. coli圖4 融合蛋白SUMO-PmCRP1在重組大腸桿菌中的表達(dá)分析

2.5 重組大腸桿菌BL21/pSUMO-PmCRP1對Cd2+、Cu2+、Zn2+的耐受性分析

為了研究BL21/pSUMO-PmCRP1重組大腸桿菌對Cd2+,Cu2+和Zn2+金屬離子耐受性,將pSUMO和pSUMO-PmCRP1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。當(dāng)Cd2+濃度大于200 μmol/L時, BL21/pSUMO-PmCRP1菌株對Cd2+耐受性顯著提高;其中,在Cd2+濃度為500 μmol/L時,實驗組比對照組菌株濃度提高了120%;當(dāng)Cd2+濃度繼續(xù)升高時,Cd2+引起的脅迫顯著上升,無論是對照組還是BL21/pSUMO-PmCRP1重組大腸桿菌濃度都顯著下降(P<0.05)(圖5A)。當(dāng)Cu2+濃度為3 mmol/L時,BL21/pSUMO-PmCRP1菌株相比對照組對Cu2+耐受性提高顯著(P<0.05),其中實驗組比對照組菌株濃度提高了17%(圖5B)。當(dāng)Zn2+濃度在200-800 μmol/L之間時,BL21/pSUMO-PmCRP1菌株對Zn2+耐受性顯著提高(P<0.05);其中,Zn2+濃度為300 μmol/L時,兩種菌株濃度差異最大,實驗組比對照組菌株濃度提高了20%倍(圖5C)。

通過平板劃線法進(jìn)一步分析Cd2+對BL21/pSUMO,BL21/pSUMO-TeMTT2和BL21/pSUMO-PmCRP1重組大腸桿菌生長的影響。將三種重組大腸桿菌在含有200 μmol/L CdCl2的LB固體培養(yǎng)基上劃線。結(jié)果顯示,陽性對照組BL21/pSUMO-TeMTT2菌株和實驗組BL21/SUMO-PmCRP1菌株都可以增殖。 BL21/SUMO-PmCRP1菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的Cd2+耐受性(圖5D)。

A.重組大腸桿菌BL21/pSUMO和BL21/pSUMO-PmCRP1在、100、200、300、400、500、600、 800、1 000 μmol/L濃度的Cd2+脅迫下生長5 h后的增殖;B.重組大腸桿菌BL21/pSUMO和 BL21/pSUMO-PmCRP1在、1、2、3、4、5、6、8、10 mmol/L濃度的Cu2+脅迫下 生長5 h后的增殖;C.重組大腸桿菌BL21/pSUMO和BL21/pSUMO-PmCRP1在、100、200、300、 400、500、600、800、1 000 μmol/L濃度的Zn2+脅迫下生長5 h后的增殖; D. 重組大腸桿菌BL21/pSUMO,BL21/pSUMO-TeMTT2和BL21/pSUMO-PmCRP1 在200 μmol/L CdCl2LB固體培養(yǎng)基的增殖Fig.5 Analysis of metal ion tolerance of recombinant E.coli BL21/pSUMO-PmCRP1圖5 BL21/pSUMO-PmCRP1重組大腸桿菌金屬離子耐受性分析

3 分析與討論

富含半胱氨酸蛋白是動植物中存在的一類小分子蛋白,在生物體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)功能,例如調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、防御、蛋白酶抑制、重金屬解毒等[1]。金屬硫蛋白是富含半胱氨酸蛋白中的一大類,能與金屬離子結(jié)合[15]。在金屬硫蛋白家族間,除了一些共同的結(jié)構(gòu)特征之外,金屬硫蛋白家族之間整體序列保守性不高,這表明不同的金屬硫蛋白家族可能在進(jìn)化過程中多次獨(dú)立發(fā)生,共同的結(jié)構(gòu)特征是多次趨同進(jìn)化的結(jié)果[4]。目前鑒定的大多數(shù)真核生物金屬硫蛋白來自有限的生物類群,并不能真實反映全部金屬硫蛋白的多樣性[16]。本實驗室在游仆蟲轉(zhuǎn)錄組中意外獲得的一種編碼富含半胱氨酸蛋白基因, 序列分析發(fā)現(xiàn)該基因為金藻基因組特異序列,我們并不清楚該基因是金藻與游仆蟲共生的產(chǎn)物還是培養(yǎng)中金藻污染的結(jié)果。然而通過PCR擴(kuò)增,在純培養(yǎng)的金藻中克隆出該基因,發(fā)現(xiàn)其編碼的PmCRP1蛋白質(zhì)具有一些廣泛存在于金屬硫蛋白中的半胱氨酸基序[2]。其半胱氨酸排列形式有CCC,CXCC,XCCX,CXC,XXCXX(C是Cys; X是Cys以外的任何氨基酸殘基),無信號肽,這些特征與金屬硫蛋白相似。PmCRP1與目前已發(fā)現(xiàn)的金屬硫蛋白家族具有共同特征,但也表現(xiàn)出其自身特點(diǎn),無法歸入現(xiàn)有的15個金屬硫蛋白家族中,這可能是一種新的金屬硫蛋白。

編碼金屬硫蛋白的基因中一般不含有內(nèi)含子,PmCRP1基因也不含內(nèi)含子,這可能與金屬硫蛋白快速誘導(dǎo)表達(dá)響應(yīng)水體環(huán)境中的重金屬離子相似[8]。但本研究結(jié)果表明,金屬離子并不能誘導(dǎo)PmCRP1上調(diào)。在種類極其豐富的金屬硫蛋白家族中,并非所有的金屬硫蛋白基因都能被金屬離子誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào),如黃瓜莖中金屬硫蛋白CsMTL2基因也不能被金屬離子誘導(dǎo)上調(diào)[17]。雖然金屬離子不能誘導(dǎo)PmCRP1基因表達(dá)上調(diào),但PmCRP1可以與Cd2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子結(jié)合。在PmCRP1中,帶電殘基Lys的數(shù)量明顯占優(yōu)勢,這對金屬結(jié)合親和力十分重要,特別是金屬硫蛋白在細(xì)胞基礎(chǔ)代謝過程中充當(dāng)金屬分子伴侶時[18]。

經(jīng)典的金屬硫蛋白首次從馬腎中分離出來,具有較強(qiáng)的Cd2+解毒特性[19],多數(shù)的金屬硫蛋白被普遍認(rèn)為可以解除Cd2+的毒性和維持金屬離子穩(wěn)態(tài)[20]。本研究中,表達(dá)PmCRP1的大腸桿菌對Cd2+的耐受性水平高于對照組,表明PmCRP1的表達(dá)通過結(jié)合環(huán)境中的Cd2+,從而增強(qiáng)細(xì)胞對Cd2+的耐受性。與表達(dá)四膜蟲金屬硫蛋白TeMTT2的菌株相比,表達(dá)PmCRP1的菌株具有更高的Cd2+耐受性(圖5D)。結(jié)果暗示PmCRP1具有金屬離子結(jié)合特性,可能是一種新的金屬硫蛋白。這為進(jìn)一步挖掘新的金屬硫蛋白及其功能提供了新的數(shù)據(jù)。