吳鵬

（浙江省腫瘤醫(yī)院病理科 浙江 杭州 310022）

利用冰凍切片技術(shù)對(duì)送檢標(biāo)本進(jìn)行術(shù)中診斷已經(jīng)普遍應(yīng)用于外科手術(shù)的快速病理診斷。自1960年Cryostat冰凍切片機(jī)應(yīng)用以來(lái)，目前國(guó)內(nèi)外臨床通過(guò)術(shù)中冰凍診斷來(lái)決定下一步的手術(shù)方式及手術(shù)范圍，已經(jīng)成為外科手術(shù)的重要方式[1]。而隨著病理從業(yè)人員素質(zhì)的提高和冰凍切片設(shè)備的更新?lián)Q代，冷凍切片質(zhì)量和常規(guī)石蠟切片差別越來(lái)越小，病理醫(yī)生對(duì)術(shù)中冰凍切片診斷的準(zhǔn)確率也得到了提高[2-4]。而伴隨著診療技術(shù)的不斷發(fā)展，各臨床科室對(duì)術(shù)中冰凍的要求也越來(lái)越高?；诖?，就需要我們對(duì)冰凍切片各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)性探討，總結(jié)一些影響冰凍切片質(zhì)量的因素和注意事項(xiàng)。來(lái)提高切片質(zhì)量以利于病理診斷和臨床診療方案的選擇。

1.材料與方法

1.1 材料

本院外科手術(shù)送檢組織標(biāo)本涉及甲狀腺、肝臟、宮頸、乳腺、卵巢、肺、腦、淋巴結(jié)及各類(lèi)切緣等。所有標(biāo)本均及時(shí)新鮮送檢，不加任何處理。

1.2 設(shè)備及耗材

采用Thermo恒溫冰凍切片機(jī)；醫(yī)用超聲耦合劑（KL-250型，杭州凱普樂(lè)醫(yī)療器械有限公司）[5]；Thermo MX35一次性刀片。

1.3 試劑

甲醇固定液[6]；改良Gill蘇木素染液[7]；醇溶性伊紅染液；促藍(lán)液；脫水用梯度酒精；二甲苯。

1.4 方法

1.4.1 取材 送檢手術(shù)標(biāo)本取材對(duì)制片的影響非常重要，不但要求及時(shí)、規(guī)范。還要注意幾點(diǎn)事項(xiàng)：（1）送檢標(biāo)本必須無(wú)固定，不經(jīng)任何液體浸泡。（2）取材臺(tái)面必須保持干凈，避免污染。（3）取材刀要鋒利，避免擠壓組織。（4）取材刀，剪，鑷子保持干凈，每次取材后洗凈，擦干。（5）組織大小厚薄適宜（1.5cm×1.5cm×0.3cm），冰凍取材可略厚（0.3～0.4cm）[8]。（6）送檢標(biāo)本遇有較多血液和液體時(shí)要充分吸干，避免冰晶形成[9]。（7）取材時(shí)盡量剔除不相關(guān)的部分（脂肪，毛發(fā)，線(xiàn)結(jié)，骨組織及鈣化）

1.4.2 包埋 根據(jù)組織大小在冷凍頭上涂上醫(yī)用超聲耦合劑，將取材后最利于診斷的切面朝上放置，并馬上置于速凍臺(tái)上速凍，同時(shí)使用冷凍錘壓置。實(shí)踐證明，使用冷凍錘壓置標(biāo)本既可以加快冷凍速度，減少冰晶的出現(xiàn)[10]。還可以壓平標(biāo)本切面，有利于切出標(biāo)本最大面。注意事項(xiàng)：（1）耦合劑略多于組織，能將組織包裹住為宜。（2）冷凍錘要輕拿輕放。（3）速凍是防止冰晶形成的有效方法。

1.4.3 切片 待新鮮組織快速冷凍后將冷凍頭移至凍頭夾，緩慢后退凍頭至合適距離開(kāi)始修片，修片過(guò)程動(dòng)作要輕柔，不可過(guò)快修片，以免組織脫落或損壞刀口。調(diào)整好防卷板位置，確認(rèn)切片厚度，開(kāi)始切片。切出一張平坦無(wú)折褶的薄片后，快速粘附于載玻片上。（1）切片刀要鋒利。（2）厚度一般以4～5μm為宜，脂肪組織可為10～15μm（見(jiàn)表1）。（3）淋巴結(jié)、肝等細(xì)胞豐富的組織在過(guò)凍發(fā)裂的情況下，可用手敷使其回溫后再行切片。（4）在使用防卷板的情況下仍無(wú)法順利出片的情況下，可用毛筆協(xié)助拉片。（5）粗修后要細(xì)切掉前面幾張，避免切片出現(xiàn)孔隙。（6）轉(zhuǎn)動(dòng)冰凍機(jī)手柄要用力均勻，切忌猛修猛切。

冰凍切片的溫度、時(shí)間控制是切片好壞非常關(guān)鍵的一步。應(yīng)根據(jù)組織的大小、厚薄、種類(lèi)來(lái)確定冷凍的時(shí)間。但是在實(shí)際工作中，由于送檢標(biāo)本數(shù)較多，頻繁調(diào)試冰凍切片機(jī)的溫度不切實(shí)際，故一般在室溫較高時(shí)將冰凍切片機(jī)箱體溫度設(shè)為-25℃左右[8]，在室溫較低時(shí)將切片機(jī)箱體溫度調(diào)至-20℃左右。速凍臺(tái)設(shè)置速凍溫度-35℃～-50℃。凍頭溫度應(yīng)根據(jù)組織情況來(lái)設(shè)置，一般設(shè)置在-20℃左右。

表1 常見(jiàn)組織凍頭溫度，冷凍時(shí)間，切片厚度建議

1.4.4 固定及染色 將粘附有薄切片的載玻片快速放入甲醇液中固定，不洗直接浸入蘇木素染液1～1.5分鐘，水洗后促藍(lán)液藍(lán)化充分水洗，入伊紅染色5～10秒，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。（1）固定液經(jīng)常更換，固定時(shí)間要充足，尤其是細(xì)胞成分豐富的組織。（2）最好使用新鮮蘇木素染液。（3）室溫過(guò)低時(shí)，最好加溫蘇木素染液再進(jìn)行染色[11]。（4）促藍(lán)液藍(lán)化后水洗要充分，防止伊紅著色欠佳。（5）切片呈云霧狀時(shí)要按順序返回到低濃度酒精重新脫水透明封固。

2.結(jié)果

針對(duì)不同組織在制片過(guò)程中的注意事項(xiàng)，制作出的切片切面平坦完整 ,厚薄均勻、無(wú)皺折，鏡下組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)清晰，染色鮮艷，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核紅藍(lán)對(duì)比明顯，細(xì)胞無(wú)明顯腫脹和收縮，無(wú)空泡，無(wú)人為裂隙及無(wú)冰晶等。鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)能完整地呈現(xiàn)，類(lèi)似于常規(guī)石蠟切片，層次分明，分辨率良好。（圖1）

圖1 細(xì)胞形態(tài)清晰，染色鮮艷，對(duì)比度好，類(lèi)似于常規(guī)石蠟切片

3.討論

術(shù)中冰凍的目的是要求在短時(shí)間內(nèi)作出準(zhǔn)確的病理診斷，幫助外科醫(yī)生確定病變的性質(zhì)，決定手術(shù)的方式和范圍。冰凍切片的原理是在低溫條件下使組織快速冷凍至一定硬度，然后進(jìn)行切片的方法。其制作過(guò)程較常規(guī)石蠟切片快速、簡(jiǎn)便。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床手術(shù)中。所以要快速完成一張高質(zhì)量的冰凍切片非常重要，各個(gè)環(huán)節(jié)要注意的細(xì)節(jié)也很多，從取材、包埋到切片、固定、染色等過(guò)程。針對(duì)不同組織要選擇不同的溫度、時(shí)間及厚度，其中冷凍溫度和時(shí)間的控制是非常關(guān)鍵的。不同組織應(yīng)該選用不同的技巧，不可一概而論。但是想要做好一張冰凍切片并非易事，這需要病理技術(shù)人員具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度、仔細(xì)的工作作風(fēng)和長(zhǎng)期的練習(xí)和摸索。對(duì)每一例送檢的病理標(biāo)本都要嚴(yán)謹(jǐn)、仔細(xì)的進(jìn)行制作。在制片工作中做到每一個(gè)環(huán)節(jié)都能精于求精。并要求能在工作之余進(jìn)行總結(jié)和經(jīng)驗(yàn)積累，從而提高自身的業(yè)務(wù)水平，為病理診斷及臨床應(yīng)用提供更好的保障。