陳 麗

(四川省安岳縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 安岳 642350)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以腹痛、腹瀉、粘液血便等為主要臨床表現(xiàn)的發(fā)生于結(jié)、直腸的非特異性炎癥疾病[1]。中醫(yī)將UC歸為“泄瀉”、“大瘕瀉”等范疇，飲食不節(jié)、外感濕熱之邪、情志失調(diào)等因素所致的脾胃虛弱為發(fā)病之本，脾胃虛弱則致水谷不化、后天失養(yǎng)，臟腑機(jī)能失調(diào)以致氣血生化無源、運(yùn)化無力，濕熱內(nèi)蘊(yùn)、壅滯腸間、搏結(jié)氣血則致脂絡(luò)受傷、腐敗成瘍，發(fā)為UC。目前多采用水楊酸類、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素治療UC，取得了一定效果，但存在療效不穩(wěn)定、用藥時(shí)間長、副作用較大等問題[2]。中醫(yī)對UC有完整的辯證及施治體系，《傷寒論·太陽病脈證并治》中便有以葛根芩連湯主治協(xié)熱下利的論述[3]。本研究觀察葛根芩連湯對UC小鼠的影響，探討葛根芩連湯對小鼠UC的療效及治療機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料雌性balb/c小鼠(川北醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心)40只，均為無特定病原體級(SPF)，體重18～20 g，6～7周齡。葡聚糖硫酸鈉(Dextran Sulfate Sodium，DSS，北京聯(lián)立信生物技術(shù)有限公司)。葛根芩連湯：葛根15 g，黃芩、黃連各9 g，甘草6 g。柳氮磺吡啶(sulfasalazine，SSZ，上海中西三維藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.25 g，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31020450)。兔抗鼠Anti-NF-κBP65多克隆抗體、兔抗鼠Anti-MFG E8/BA 46多克隆抗體、兔抗鼠Anti-OCLN/occludin多克隆抗體、SA1022-兔Ig G SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，均來自博士德生物工程有限公司；兔抗鼠Anti-TNF-α多克隆抗體來自博奧森生物科技有限公司。蛋白質(zhì)抽提試劑盒及PCR提取試劑盒均購自廣州英偉創(chuàng)津公司。引物(β-actin)由上海森工及大連寶生物有限公司合成。美國Bio-Tek公司Epoch連續(xù)波長酶標(biāo)儀，National Institutes of Health Image J 2.1.4.7，BIORAD電泳儀，Odyssey CLX紅外熒光掃描成像系統(tǒng)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及動物模型建立將40只balb/c小鼠分為A組(空白對照組，蒸餾水，n=10)、B組(模型組，DSS+蒸餾水，n=10)、C組(SSZ組，DSS+SSZ，n=10)及D組(葛根芩連湯組，DSS+葛根芩連湯，n=10)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，除A組外，B、C、D各組小鼠均連續(xù)7 d予以5%DSS(分子量36000～50000)溶液代替飲用水供其自由飲用，隔天更換一次。造模同時(shí)相應(yīng)藥物灌胃或予以蒸餾水，劑量3 μg/g·d，持續(xù)7 d。

1.3觀察及取材每日觀測、記錄的小鼠的體重、大便性狀和便血情況，記錄疾病活動指數(shù)(DAI)評分[4]，評分標(biāo)準(zhǔn)：包括體重下降、大便性狀、出血3個(gè)方面，體重下降0%、1%～5%、5%～10%、10%～15%、>15%分別記0～4分，大便性狀正常、松散、稀便分別記0、2、4分，大便隱血正常、隱血陽性、肉眼血便分別記0、2、4分；DAI=體重下降+大便性狀+出血得分。第8 d采取頸椎脫臼法處死各組小鼠。剖開小鼠腹部，迅速取出整個(gè)結(jié)腸段，測定結(jié)腸長度及濕重，觀察結(jié)腸充血、水腫、大便團(tuán)分布等情況，解剖出小鼠脾臟，計(jì)算脾指數(shù)。取材1：于距結(jié)腸末端5 mm或10 mm處橫切切取一段5 mm左右直腸，縱行剖開于PBS液漂洗2次，然后經(jīng)液氮罐轉(zhuǎn)入-70 ℃冰箱保存，用于分子生物學(xué)檢測；其余結(jié)腸浸潤固定于10%的福爾馬林溶液中，24 h后轉(zhuǎn)入70%保存(4 ℃)。取材2：對于固定后的結(jié)腸，首先把另一段直腸(5 mm長，距肛門5 mm或10 mm)橫切成等高的2段，包埋于石蠟中。其余剩下的近胃端結(jié)腸則等距隨機(jī)取2塊(橫切，碰到大便位置在大便旁邊切)，包埋在一起。

1.4病理組織學(xué)檢測取結(jié)腸組織石蠟塊行4 μm連續(xù)組織切片，烤片，HE染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織病理損傷，并進(jìn)行組織損傷評分[5]。

1.5免疫組化法檢測將結(jié)腸組織石蠟塊行3 μm連續(xù)切片，置于58～60 ℃烤箱中30～60 min，使切片組織緊密粘附于過多聚賴氨酸處理后的載玻片，實(shí)驗(yàn)步驟為切片脫蠟、脫水、滅活、抗原修復(fù)、封閉、滴加一抗、沖洗、DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。采用Image J 2.1.4.7軟件測量免疫組織化學(xué)圖像平均灰度值，NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin等陽性物質(zhì)平均灰度值越低提示其含量越高。

1.6結(jié)腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin蛋白表達(dá)定量檢測取結(jié)腸組織，液氮研磨，加RAPI裂解液，置于冰上，超聲組織破碎儀提取蛋白，10 min后，12000 rpm/min離心15 min，取上清液，采用Western-bloting技術(shù)定量檢測NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin的表達(dá)情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用F檢驗(yàn)及SNK-q檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DAI評分、組織損傷評分及病理形態(tài)學(xué)觀察

B、C、D組建模第7d時(shí)DAI評分、建模第8d時(shí)組織損傷評分均大于A組，且B組大于C、D組(P< 0.05)；C、D組上述評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。A組鏡下可見腸黏膜、腺體結(jié)構(gòu)層次清楚、完整，無或極少炎癥細(xì)胞浸潤(圖1a)。B組鏡下可見腸黏膜組織細(xì)胞、腺體結(jié)構(gòu)遭受不同程度破壞，層次結(jié)構(gòu)不清，排列紊亂，伴廣泛炎癥細(xì)胞浸潤，主要累及黏膜和黏膜下層(圖1b)。C組鏡下可見腸黏膜組織細(xì)胞、腺體結(jié)構(gòu)遭受破壞程度顯著較B組輕，浸潤的炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著較B組少，黏膜結(jié)構(gòu)有不同程度恢復(fù)(圖1c)。D組鏡下可見腸黏膜組織細(xì)胞、腺體結(jié)構(gòu)遭受破壞程度與C組相近，浸潤的炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著較B組少，黏膜結(jié)構(gòu)有不同程度恢復(fù)(圖1d)。

表1 四組DAI評分、組織損傷評分比較 (分)

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05

圖1 各組小鼠病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色) a：A組； b：B組； c：C組； d：D組

2.2結(jié)腸長度、結(jié)腸質(zhì)量及脾指數(shù)建模第8 d時(shí)，A、C、D組結(jié)腸長度大于B組，結(jié)腸質(zhì)量、脾指數(shù)小于B組(P< 0.05)；且A、C、D上述指標(biāo)檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見表2。

表2 四組結(jié)腸長度、結(jié)腸質(zhì)量及脾指數(shù)比較

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05

2.3結(jié)腸黏膜免疫組織化學(xué)圖像觀察及NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值比較建模第8d時(shí)，四組結(jié)腸黏膜NF-кB、TNF-α平均灰度值水平均顯示A>C>D>B，MFG-E8、occludin平均灰度值水平均顯示A

圖2 NF-кB免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

表3 四組結(jié)腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值比較

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05；c與C組比較，P < 0.05

圖3 TNF-α免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

圖4 MFG-E8免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

圖5 occludin免疫組化圖 a：陰性對照圖；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

2.4結(jié)腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin蛋白相對表達(dá)情況建模第8d時(shí)，四組結(jié)腸黏膜NF-кB、TNF-α蛋白相對表達(dá)量均顯示AC>D>B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，見表4。

表4 四組結(jié)腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin表達(dá)情況比較

a與A組比較，P < 0.05；b與B組比較，P < 0.05；c與C組比較，P < 0.05

3 討論

近年UC發(fā)病率隨人們飲食結(jié)構(gòu)的改變和生活水平的提高呈上升趨勢，且UC易反復(fù)發(fā)作，多遷延日久，易對患者身心健康造成嚴(yán)重影響[6]。UC的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，相關(guān)研究顯示其與炎癥反應(yīng)、腸道屏障功能缺陷和菌群失調(diào)等因素有關(guān)[7]。

常規(guī)水楊酸類、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素治療雖取得了一定效果，但存在療效不穩(wěn)定、用藥時(shí)間長、副作用較大等問題[8]。葛根芩連湯作為中藥湯劑，可針對UC患者脾胃虛弱為本，濕熱內(nèi)蘊(yùn)、痰濕停滯、瘀血阻滯為標(biāo)的主要病理特點(diǎn)，提出了外疏內(nèi)清、表里同治的治療方法[9]。本研究中，予葛根芩連湯的D組UC小鼠DAI評分、組織損傷評分均低于未予治療的B組，且上述評分與予SSZ的C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)腸長度、結(jié)腸質(zhì)量及脾指數(shù)與A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示葛根芩連湯對減輕UC小鼠病變程度和結(jié)腸組織損傷范圍有一定幫助。

脾主運(yùn)化、統(tǒng)血，正常情況下，機(jī)體脾氣健運(yùn)，機(jī)體消化吸收、水谷精微輸布功能健全，從而維持正常的生理活動。UC患者因患病日久濕毒瘀滯、情志內(nèi)傷等因素而正虛邪實(shí)，脾氣不足則致脾失健運(yùn)，水谷不運(yùn)，氣血生化無源，使患者出現(xiàn)消瘦乏力、面色無華、泄瀉等癥。同時(shí)，脾氣不足亦可致中氣下陷，內(nèi)臟下垂，引起肛門墜脹等癥。方中以葛根為君，辛甘而涼，入脾胃經(jīng)，既能解表退熱，又可輕清升散，升舉脾胃清陽之氣，使津液布行，止瀉止痢。黃連、黃芩共為臣藥，行清熱燥濕、瀉火解毒、厚腸止利之功，有效改善UC所致濕熱中阻、痞滿、瀉痢等癥。藥理研究顯示，葛根芩連湯具有良好的解熱、抗菌、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、解痙及增強(qiáng)免疫作用[10]，適用于對UC的治療。

文獻(xiàn)顯示，Toll樣受體(TLRs)/NF-κB信號傳導(dǎo)通路參與了UC發(fā)病機(jī)制，在調(diào)節(jié)涉及黏膜炎癥反應(yīng)中起核心作用[11]。NF-κB抑制因子磷酸化IκB炎癥信號刺激下被泛素化降解，從細(xì)胞膜向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，調(diào)控C-MYC、CDK1等下游相關(guān)靶基因釋放，參與細(xì)胞周期、凋亡、癌變。TLRs/NF-κB的過度激活亦將導(dǎo)致TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥介質(zhì)的過度表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)，造成腸黏膜屏障的損傷。TNF-α可誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附分子的表達(dá)使白細(xì)胞募集，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生一氧化氮分子，并可激活NF-κB，形成惡性循環(huán)，直接或間接導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷[12]。MFG-E8作為一種親脂性糖蛋白，可使損傷的腸黏膜上皮細(xì)胞在其促腸上皮細(xì)胞遷移作用下加速修復(fù)，并可與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，誘發(fā)潰瘍邊緣腸上皮細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)[13]。occludin蛋白則是構(gòu)成腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接的主要蛋白，對阻止有害物質(zhì)滲入黏膜下層有重要意義，因此其表達(dá)情況可反映黏膜屏障功能的變化[14]。本研究中，予以葛根芩連湯治療的D組UC小鼠結(jié)腸黏膜NF-кB、TNF-α、MFG-E8及occludin平均灰度值、蛋白相對表達(dá)量改善情況雖不及予以SSZ治療的C組，但顯著均優(yōu)于未予以治療的模型組，提示該中藥湯劑對改善腸道炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腸黏膜修復(fù)有一定幫助。祁燕等[15]采用具有健脾勝濕、清熱解毒的中藥湯劑治療UC小鼠，發(fā)現(xiàn)其可有效減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，與本研究基本一致。

綜上所述，葛根芩連湯可減輕UC小鼠病變程度和結(jié)腸組織損傷范圍，改善腸道炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，對UC治療有重要意義。