植茂輝 鄭焱江劉莉華 李嘉豪 廖詩平

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院機能學(xué)實驗室，四川 成都 610041)

結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是全球發(fā)病率排名第三的惡性腫瘤[1]，主要由基因缺陷導(dǎo)致[2]。在眾多的突變基因當中，Ras家族在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。該家族由K-Ras、H-Ras和N-Ras組成。Ras基因編碼的Ras蛋白分子量為21 kDa，屬于小G蛋白，參與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而影響細胞的增殖和分化[3]。研究表明，Ras突變引起的Ras蛋白持續(xù)表達是導(dǎo)致多種腫瘤惡性程度增加的原因之一。在CRC中約有40%的K-Ras突變[4]，這種突變往往導(dǎo)致化療耐藥并加重患者的病情進展。

槲皮素一種黃酮類化合物，具有特定的分子結(jié)構(gòu)且被歐洲藥典所認同。迄今為止，大量研究證實了槲皮素的抗腫瘤作用，如髓性白血病[5]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[6]以及結(jié)直腸癌[7-8]。但缺乏槲皮素抑制CRC細胞系體外增殖的作用機制研究。本文擬從細胞凋亡和RAS相關(guān)信號通路的角度，研究槲皮素體外特異性抑制K-Ras突變的CRC細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

野生型人結(jié)直腸癌上皮細胞系DLD1K-RASWT和K-RAS基因突變型人結(jié)直腸癌上皮細胞系DLD1K-RAS G13D由哈佛醫(yī)學(xué)院的Dr. Kevin M Haigis提供，均使用含10%胎牛血清和青霉素(10,000 U·ml-1)和鏈霉素(10 mg·ml-1)的DMEM培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。

1.1.2 試劑

槲皮素(成都曼思特生物科技有限公司，純度：98%以上，DMSO稀釋成相應(yīng)的濃度)； AKT/p-AKT抗體、ERK/p-ERK抗體、JNK/p-JNK抗體、MEK/p-MEK抗體及β-actin抗體(Sigma，美國)；Annexin V-FITC流式抗體(Roche，瑞士)；0.25%胰蛋白酶(Sigma，美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組

將生長情況良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT細胞根據(jù)所加槲皮素劑量的不同，分為6組：DLD1K-RAS WT+0μM槲皮素組(wt-0組)、DLD1K-RAS WT+50μM槲皮素組(wt-50組)、DLD1K-RAS WT+100μM槲皮素組(wt-100組)、DLD1K-RAS G13D+0μM槲皮素組(1-0組)、DLD1K-RAS G13D+50μM槲皮素組(1-50組)、DLD1K-RAS G13D+100μM槲皮素組(1-100組)。

1.2.2 MTT實驗

將生長情況良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT細胞接種于96孔板中，每孔1×105個；37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；加入不同劑量的槲皮素培養(yǎng)24 h后；加入0.5 mg·ml-1MTT溶液(無血清培養(yǎng)基配制，4℃避光保存)110 μl繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h時；棄上清，加入DMSO 200 μl溶解；25℃振蕩5 min后，使用Bio-Rad酶標儀在490 nm波長下檢測吸光度值(A490)。

1.2.3 集落形成實驗

將生長情況良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT細胞懸液培養(yǎng)于6孔板中，每孔2000個，加入不同劑量的槲皮素培養(yǎng)72 h后；磷酸緩沖液(PBS)清洗兩次后，每孔加入4%甲醛1 ml室溫固定5 min；0.1%結(jié)晶紫染色1 h，流水沖洗后晾干，獲得照片。每孔加入33%醋酸1 ml溶解，每孔取200 μl于96孔板，使用Bio-Rad酶標儀于590 nm檢測吸光度值(A590)。

1.2.4 Western blot實驗

將生長情況良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT細胞懸液培養(yǎng)于6孔板中，加入不同劑量的槲皮素培養(yǎng)24 h后；裂解細胞收集蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、4℃一抗孵育過夜(抗體及稀釋比見表1)、洗膜、二抗室溫孵育2 h、洗膜、曝光后，采用Quantity ONE軟件以β-actin為內(nèi)參對WB條帶進行半定量分析，實驗所用抗體見表1。

表1 抗體來源和稀釋度

1.2.5 流式細胞實驗

將生長情況良好的DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT細胞懸液培養(yǎng)于6孔板中，每孔4×105個；加入0 μM、50 μM、100 μM槲皮素處理24 h后；使用胰酶進行消化，收集細胞；結(jié)合緩沖液(Binding buffer)重懸，各孔加入Annexin-Ⅴ流式抗體1 μl，室溫孵育15 min；隨即運用BD FAC Scan flow cytometer檢測Annexin V-FITC染色陽性百分數(shù)為檢測樣本細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對細胞增殖的影響

在不同劑量的槲皮素處理下，與DLD1K-RAS WT組相比，1-50、1-100組增殖能力明顯低于、wt-50、wt-100組(P<0.05)，見圖1A。經(jīng)過三次獨立重復(fù)的集落形成實驗后，與DLD1K-RAS WT組相比，1-50、1-100形成集落能力明顯低于wt-50、wt-100組(P<0.001)，見圖1B和1C。

圖1 槲皮素抑制K-Ras突變的細胞增殖注：A：MTT染色檢測DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT細胞增殖能力；B：槲皮素處理后DLD1K-RAS G13D和DLD1K-RAS WT集落形成能力；C：集落形成實驗定量分析結(jié)果。與對照組相比，*P<0.05。

2.2 槲皮素對細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結(jié)果可看出，1-100組約有25%的細胞發(fā)生凋亡，而wt-100組凋亡率不到10%，見圖2A。與DLD1K-RAS WT組相比，1-25、1-50、1-100組凋亡率明顯高于wt-25、wt-50、wt-100組(P<0.001～0.01)，見圖2B。

2.3 槲皮素通過激活caspase誘導(dǎo)K-Ras突變細胞凋亡

與DLD1K-RAS WT相比，1-50和1-100組cleaved-caspase-3表達量明顯增高，見圖3A。為進一步明確槲皮素誘導(dǎo)細胞凋亡的信號通路，分別采用caspase-3、8、9抑制劑抑制caspase信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DLD1K-RAS WT相比，DLD1K-RAS G13D分別加入Z-DEVD、Z-IETD、Z-LEHD阻斷caspase-3、8、9后再加入作用，各組凋亡均受到明顯抑制(P<0.05)。Caspase-3、8、9的抑制劑均可明顯抑制細胞凋亡，說明上述通路均參與了槲皮素誘導(dǎo)細胞凋亡，見圖3B和3C。

圖2 槲皮素誘導(dǎo)K-Ras突變的細胞凋亡注：A：流式細胞技術(shù)測定；B：細胞凋亡的定量分析。與對照組相比，*P<0.05。

圖3 槲皮素激活caspase信號通路A：Western Blotting檢測cleaved-caspase-3表達；B：流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡；C：流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡的定量分析結(jié)果。與對照組相比，*P<0.05。

2.4 槲皮素對K-Ras相關(guān)下游信號蛋白的調(diào)節(jié)作用

槲皮素處理細胞后，MEK相應(yīng)的磷酸化蛋白在兩種細胞中表達并無差異，而ERK蛋白磷酸化水平在兩株細胞中表達水平均升高。但是磷酸化的AKT(p-AKT)在K-Ras突變的CRC細胞DLD1K-RAS G13D中的表達隨槲皮素濃度增加表達降低(P<0.05), 而磷酸化的JNK(p-JNK)隨槲皮素濃度增加表達升高(P<0.05)，見圖4A和B。

圖4 AKT信通路參與了槲皮素誘導(dǎo)K-Ras突變細胞凋亡注：A：Western Blotting檢測K-Ras相關(guān)下游信號分子表達；B：半定量分析Western Blotting結(jié)果。與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，多個基因突變參與了從腺瘤到腺癌的各個階段[9]。在結(jié)直腸癌患者中K-Ras突變率為35-45%，被認為是腫瘤發(fā)生的早期事件之一，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移、患者的預(yù)后以及臨床治療效果密切相關(guān)[10]。Ras蛋白活化后可激活包括AKT、MEK-ERK和JNK在內(nèi)的多條信號傳導(dǎo)通路，是調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的關(guān)鍵性分子[11]。目前尚沒有特異性針對K-Ras的抑制劑，因此有關(guān)K-Ras突變腫瘤的治療仍然是臨床難點[12]。

本文通過研究槲皮素對K-Ras突變型和野生型CRC細胞的增殖能力影響，發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抑制CRC細胞增殖，且K-Ras突變的DLD1K-RAS G13D細胞對槲皮素更加敏感。而且100μM槲皮素能誘導(dǎo)約25%的DLD1K-RAS G13D細胞發(fā)生凋亡，而非K-Ras變異細胞DLD1K-RAS WT凋亡率明顯低于K-Ras變異細胞株。

為進一步明確槲皮素誘導(dǎo)的細胞凋亡的途徑，我們檢測了槲皮素作用后caspase家族中凋亡執(zhí)行者caspase-3的活化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K-Ras突變的DLD1K-RAS G13D細胞在槲皮素作用后caspase-3被活化。進一步采用不同的caspase通路抑制劑作用于細胞后，槲皮素誘導(dǎo)細胞凋亡的能力均顯著下降，可見槲皮素誘導(dǎo)的細胞凋亡時可能包括了caspase-8介導(dǎo)的外源性細胞凋亡途徑和caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性細胞凋亡途徑。

為明確槲皮素能夠特異的誘導(dǎo)K-Ras突變的DLD1細胞發(fā)生凋亡的機制，我們檢測經(jīng)典的Ras下游信號分子活化情況。結(jié)果顯示槲皮素抑制DLD1K-RAS G13D細胞種AKT和JNK信號通路的活化情況。因此我們推測，槲皮素通過調(diào)節(jié)K-Ras下游信號通路而特異性的誘導(dǎo)K-Ras變異細胞凋亡。

綜上所述，我們的研究結(jié)果初步提示槲皮素特異性的抑制K-Ras突變的DLD1細胞增殖，能夠誘導(dǎo)細胞通過caspase通路發(fā)生凋亡，AKT信號通路活化被抑制參與了槲皮素誘導(dǎo)的細胞凋亡。但是K-Ras相關(guān)眾多的信號通路交錯復(fù)雜，是否有其他的信號共同參與有待進一步研究。本實驗結(jié)果只是選取了K-Ras突變的CRC細胞系，除了DLD1以外，槲皮素對其他的細胞系以及其他腫瘤K-Ras突變的細胞系是否有這種廣譜的作用還有待證實。