楊 儉，魏 偉，唐保軍*

(1. 上格環(huán)境科技(上海)有限公司,上海 200062; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090)

文蛤(Meretrixmeretrix)屬于軟體動物門，雙殼綱，簾蛤科，主要分布在河口、淺灘地區(qū)，是中國沿海重要的經(jīng)濟(jì)灘涂貝類之一[1]。溫度是影響海洋生物生長、分布的重要環(huán)境因子[2-3]。在潮間帶生活的貝類，經(jīng)常因升、降溫而遭受溫度脅迫，夏季的高溫脅迫甚至?xí)?dǎo)致貝類大量死亡[4-6]。代謝率是反映貝類生理狀況的重要指標(biāo)[7-10]，有關(guān)溫度脅迫下貝類生理代謝變化的研究已有較多報道[11-13]，但大多研究只關(guān)注脅迫一定時間后貝類的代謝率，而對于脅迫過程中貝類的代謝率變化研究較少。通過測定溫度脅迫后不同時間點(diǎn)文蛤的耗氧率和排氨率，從文蛤應(yīng)對溫度脅迫的整個過程出發(fā)，探討其生理響應(yīng)機(jī)制，為貝類逆境適應(yīng)研究和健康養(yǎng)殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究所用文蛤采自江蘇啟東沿海灘涂，采樣點(diǎn)海水鹽度為21，選擇大小相近的文蛤約900只，去掉附著生物后暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間，保持海水鹽度21、溫度(25±1)℃，每天換水50%，投喂小球藻(Chlorellavulgaris)1次，持續(xù)充氣。采用海水晶配制濃鹽水，進(jìn)而添加淡水配制暫養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)用海水。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個溫度處理組，分別為20、25、30、35℃，其中25℃為對照組。實(shí)驗(yàn)開始時，挑選700只健康文蛤，為防止高溫死亡個體較多影響呼吸實(shí)驗(yàn)取樣，按150、150、200、200只分別放到溫度為20、25、30、35℃的4個玻璃水槽中。分別于3、12、24、48、72、96 h測定急性溫度脅迫后文蛤的耗氧率和排氨率，各水槽每天用同溫度海水換水50%。

1.2 代謝率測定方法

耗氧率和排氨率采取靜水法測定。每個溫度處理組設(shè)置3個平行組和1個空白對照。采用3 L呼吸瓶，實(shí)驗(yàn)組每個呼吸瓶中放4只文蛤，空白組不放。采用虹吸法向各呼吸瓶注入相應(yīng)溫度的海水，密封后放入恒溫水槽中水浴，實(shí)驗(yàn)持續(xù)3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各呼吸瓶內(nèi)的水樣，測定溶解氧和氨氮濃度，測量瓶內(nèi)文蛤的殼長、濕重等生物學(xué)數(shù)據(jù)，解剖取軟體部于65℃烘干24 h后稱干質(zhì)量，見表1。

表1 文蛤生物學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Biological data of clams

采用Winkler碘量法測定水樣溶解氧濃度，耗氧率計(jì)算公式如下：

R=V×(O0-Ot)/(W×t)

(1)

式(1)中，R為文蛤單位體質(zhì)量耗氧率，O0和Ot分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時空白呼吸瓶和實(shí)驗(yàn)瓶中溶解氧濃度(mg·L-1)，V為呼吸瓶的體積(L)，W為文蛤軟體部干質(zhì)量(g)，t為實(shí)驗(yàn)時間(h)。

采用次溴酸鹽氧化法測定水樣氨氮濃度，排氨率計(jì)算公式如下：

E=V× (Nt-N0) / (W×t)

(2)

式(2)中，中，E為單位體質(zhì)量排氨率，N0和Nt分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時空白呼吸瓶和實(shí)驗(yàn)瓶中的氨氮濃度(μg·L-1)，V為呼吸瓶的體積(L)，W為文蛤軟體部干質(zhì)量(g)，t為實(shí)驗(yàn)時間(h)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Excel軟件分析數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(ANOVA)，顯著性差異水平設(shè)置為P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 耗氧率

結(jié)果顯示，高溫脅迫對文蛤耗氧率具有顯著影響(P<0.05)(圖1)。與對照組(25℃)相比，20℃處理組文蛤耗氧率變化不顯著。30℃處理組文蛤的耗氧率一直呈極顯著升高(P<0.01)。35℃處理組文蛤耗氧率在3 h顯著升高(P<0.05)，其后逐漸降低，在48 h后未測出耗氧率值。35℃處理組12 h后開始有文蛤死亡，48 h后文蛤死亡率超過50%，72 h后死亡率高達(dá)97%。

圖1 溫度脅迫對文蛤耗氧率的影響Fig. 1 Oxygen consumption rate of M. meretrix after heat stress 注：圖上方星號表示同一時間點(diǎn)試驗(yàn)組與對照組有顯著差異(P<0.05) Note: Asterisk above the bar indicates significant differences between the treatment and control group at the same time (P<0.05)

2.2 排氨率

與對照組(25℃)相比，20℃處理組文蛤的排氨率在12 h顯著降低(P<0.05)，至24 h時達(dá)到最小值，在48 h后上升到對照組水平，呈先降低后升高的規(guī)律。30℃處理組文蛤的排氨率自12 h起顯著降低(P<0.05)，到72 h時達(dá)最小值，在96 h未測出排氨率值，呈逐漸降低的規(guī)律。35℃處理組文蛤在3 h排氨率顯著升高(P<0.05)，其后未測出排氨率值，到72 h文蛤死亡。

圖2 溫度脅迫對文蛤排氨率的影響Fig.2 Ammonia excretion rate of M. meretrix after heat stress 注：圖上方星號表示同一時間點(diǎn)處理組與對照組有顯著差異(P<0.05) Note: Asterisk above the bar indicates significant differences between the treatment and control group at the same time (P<0.05)

3 討論

海水貝類生活的河口、灘涂地區(qū)因晝夜或季節(jié)變化會發(fā)生溫度波動，貝類需調(diào)整生理代謝活動以適應(yīng)環(huán)境變化[13]。關(guān)于海水溫度與貝類耗氧率之間的關(guān)系，相關(guān)研究報道表明：在一定溫度范圍內(nèi)，多數(shù)貝類的耗氧率與海水溫度呈正相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)中，20℃處理組的文蛤耗氧率與對照組相比無顯著變化，而30℃脅迫處理后文蛤的耗氧率顯著升高，這與馮建彬等[15]的研究結(jié)果一致，說明文蛤的生理代謝對高溫更敏感。推測原因是由于溫度上升提高了貝類組織、器官內(nèi)相關(guān)酶的活性，從而加快了體內(nèi)的各生化反應(yīng)的速率，導(dǎo)致耗氧率升高。研究表明，貝類存在最高、最低和最適的溫度范圍，如果超出最適范圍，貝類正常的新陳代謝會受到破壞。本實(shí)驗(yàn)中，溫度上升到35℃后，文蛤的耗氧率先升高后下降，最后出現(xiàn)死亡，說明該溫度已超過了文蛤的耐受極限。在毛蚶(Scapharcasubcrenata)[16]和海灣扇貝(Argopectenirradians)[17]中也有類似報道。

20℃處理組的文蛤排氨率始終低于對照組，隨著溫度上升，文蛤的排氨率顯著升高，說明高溫對文蛤的排氨率影響更顯著。在遭受環(huán)境脅迫時，貝類可通過提高能量代謝應(yīng)對不利條件，加快體內(nèi)能量物質(zhì)的消耗。貝類的排泄物有氨、尿素和氨基酸等。因此，排氨率是反映貝類代謝強(qiáng)度和脅迫程度的重要指標(biāo)。20℃處理組文蛤的排氨率先降低后升高，這可能源于文蛤的代謝適應(yīng)。有研究表明，溫度脅迫會引發(fā)海洋無脊椎動物的生理補(bǔ)償，比如濾水率和耗氧率的變化，從而導(dǎo)致排氨率的變化[18-20]，這是潮間帶生物對環(huán)境溫度波動的一種適應(yīng)機(jī)制[21]。代謝產(chǎn)生的氨主要來源于氨基酸的脫氨基作用[22]，30℃處理組文蛤的排氨率逐漸下降，說明體內(nèi)氨基酸代謝水平下降。可能是在急性脅迫初期，文蛤需要的能量較多，機(jī)體通過增加蛋白質(zhì)代謝以應(yīng)對環(huán)境脅迫，而隨著文蛤逐漸適應(yīng)高溫環(huán)境后，更多依靠碳水化合物的消耗提供機(jī)體所需能量，從而導(dǎo)致排氨率的下降。35℃處理組的文蛤在3 h排氨率顯著升高，之后卻未測得排氨率值，說明35℃已超出了文蛤的耐受極限，具體的機(jī)制需要進(jìn)一步開展研究。