林成立

(福建省林業(yè)科技試驗中心，福建 南靖363600)

山烏桕(Sapiumdiscolor(Champ.exBenth.)Muell.Arg)屬于大戟科烏桕屬植物，為落葉喬木或灌木，高度在3～12m左右，廣泛分布于江西、云南、福建等長江以南的多個省區(qū)，為中國特有的經(jīng)濟樹種[1]。目前，國內(nèi)針對山烏桕的研究報道現(xiàn)主要集中在分類特征、食品工藝、化學成分分析、苗木繁育等方面[2～6]。山烏桕樹干通直、樹皮光滑、樹形優(yōu)美，葉片在秋冬季轉(zhuǎn)色變紅，十分美觀，具有較高的園林觀賞價值。彩葉樹種葉片轉(zhuǎn)色過程，是葉綠素不斷降解、花色苷和類胡蘿卜素和一些其他色素不斷累積而共同作用的結(jié)果[7～9]。為進一步揭示山烏桕葉片轉(zhuǎn)色機制，本研究以山烏桕的葉片為研究材料，提取轉(zhuǎn)色前后10個家系山烏桕葉片的葉綠素、類胡蘿卜素及花色苷，檢測3種色素轉(zhuǎn)色前后的含量變化，鑒定花色苷組分，初步揭示了山烏桕葉片的轉(zhuǎn)色機理，可為山烏桕觀賞性價值的開發(fā)應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗材料來源于福建省洋口國有林場山烏桕試驗林。試驗林中有10個家系，種源來源于福建省林業(yè)科技試驗中心所選的10株山烏桕樹，依次編號為1～10。在試驗林中隨機選取各家系樣株4株，做好標記。在葉片變色前后分別在東南西北4個方位各收集葉片20片。山烏桕為冬季全落葉喬木，因此所采葉片均為當年生。采集時間分別為2016年12月6日和12月29日。樣品夾冰送回實驗室，液氮速凍，置于-40°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 葉綠素和類胡蘿卜素含量的測定

參考王學奎[10]的方法，采用分光光度法測定葉綠素和類胡蘿卜素含量。

1.2.2 花色苷含量的測定

花色苷的提取及含量測定參照林植芳等[11]的方法。

1.2.3 花色苷的提取和純化

山烏桕葉片花色苷的提取、分離純化參考Zhang等[9]的方法。取轉(zhuǎn)色后山烏桕葉片20g，按照1︰5(w/v)加入經(jīng)過冰浴冷卻的1%的鹽酸甲醇溶液，并用研磨棒研磨充分至勻漿狀態(tài)。在4°C的條件下提取過夜。萃取液用濾紙進行過濾，濾液在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至10mL左右。將濃縮后的濾液上XAD-7柱 (2.5cm×20cm)，以水洗2個柱體積以去除柱內(nèi)雜質(zhì)，而后用0.1% HCl甲醇溶液進行洗脫，分部收集并分別測定光密度D510nm。收集合并高峰管，在40℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至粉末狀，而后以0.1% HCl甲醇溶液進行充分溶解，離心去除不溶性雜質(zhì)，上清即為初純化的花色苷溶液。

初純化樣品過Sephadex LH-20柱 (1.0cm×55cm，1%蟻酸溶液平衡)，以1%蟻酸溶液洗脫。分部收集并分別測定光密度D510nm，收集合并高峰管，旋轉(zhuǎn)蒸干。用一定量的1%蟻酸溶液進行充分溶解，獲得純化的山烏桕葉片中的花色苷樣品[9]。

1.2.4 花色苷的HPLC ESI-MS/MS鑒定

將柱純化獲得的花色苷樣品，按照以下程序進行HPLC-MS/MS分析。

HPLC(Agilent 1260) 色譜條件為：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱 (2.1mm×100mm，3.5μm)，柱溫35℃，流速0.3mL/min，紫外-可見光檢測器。采用梯度洗脫方式，流動相A為2.5%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，洗脫程序：0～1.0min，10%溶劑B；1.0～9.0mim，10%～80%溶劑B；9.0～11.0mim，80%溶劑B。質(zhì)譜 (Agilent 6410) 條件為：電噴霧(ESI)，毛細管電壓3.5kV；離子源溫度350°C；干燥器 (N2) 流速：11L/min，霧化壓力：2.4138MPa；Delta EMV：300V；Mass采集范圍：100～2000m/z。選用正離子模式檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將數(shù)據(jù)輸入至EXCEL和DPS軟件，并進行相關統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)色前后葉綠素含量的變化

圖1 山烏桕葉片葉綠素a含量變化

實驗結(jié)果如圖1～3所示，可見供試的樣品中只有家系7在轉(zhuǎn)色前后葉綠素含量無顯著性差異，其他家系的山烏桕葉片轉(zhuǎn)色后葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著高于轉(zhuǎn)色前。山烏桕葉片中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量總體呈下降趨勢。

2.2 轉(zhuǎn)色前后類胡蘿卜素的變化

實驗結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)色前后不同家系山烏桕葉片中的類胡蘿卜素含量變化趨勢不同，家系1和9的含量顯著下降，而家系8的顯著上升，其他家系轉(zhuǎn)色前后含量差異不顯著。與葉綠素轉(zhuǎn)色前后的變化趨勢不同，不同家系山烏桕葉片中的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)色后含量更趨于接近，而野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同家系葉色轉(zhuǎn)紅的程度卻不同。因此，推測類胡蘿卜素在山烏桕葉色變紅過程中所起的作用可能不大。

2.3 轉(zhuǎn)色前后花色苷含量的變化

轉(zhuǎn)色前后葉片花色苷含量的變化如圖5所示，轉(zhuǎn)色期間不同家系的山烏桕葉片其花色苷含量均急劇累積。山烏桕葉片轉(zhuǎn)色前各家系葉片中的花色苷色素含量均小于0.32mg/g FW，相對于山烏桕葉片變紅后的含量，轉(zhuǎn)色前的花色苷含量幾乎可以忽略不計。山烏桕葉片轉(zhuǎn)色后花色苷含量至少是轉(zhuǎn)色前的10倍，呈顯著上升趨勢。

2.4 山烏桕葉片花色苷的分離、純化

將經(jīng)過過夜提取的花色苷過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后所得的濃縮液過水平衡的XAD-7柱，洗脫獲得1個D510nm高峰(圖6)。收集合并高峰管17～27，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后過分子篩Sephadex LH-20。分子篩色譜結(jié)果表明(圖7)，山烏桕花色苷在Sephadex LH-20柱上只顯示單一組分峰，該組分與分子篩介質(zhì)具較強疏水作用力，致使其洗脫出峰很慢。合并收集D510nm的高峰管，旋轉(zhuǎn)蒸干后再以1%蟻酸進行溶解，獲得純化的山烏桕花色苷溶液。

圖2 山烏桕葉片葉綠素b含量變化圖3 山烏桕葉片總?cè)~綠素含量變化

圖4 山烏桕葉片總類胡蘿卜素含量變化圖5 山烏桕葉片花色苷含量變化

圖6 花色苷在XAD-7柱上的洗脫曲線圖7 花色苷在Sephadex LH-20柱上的洗脫曲線

2.5 山烏桕葉片花色苷的結(jié)構鑒定

將純化得到的山烏桕葉片花色苷進行HPLC-MS/MS分析，對比紫外254nm和可見光區(qū)510nm檢測結(jié)果，顯示樣品的花色苷為單一組分，即保留時間(RT)為7.0min的色譜峰(圖8)。

圖8 山烏桕葉片花色苷的高效液相色譜(HPLC)圖

ESI正離子模式下的質(zhì)譜全離子掃描結(jié)果顯示(圖9、圖10)，在RT為7.0～7.8min間，最主要含1個質(zhì)荷比(m/z)為449.2的離子，此外還具1個質(zhì)荷比為287.1的離子。

圖9 山烏桕葉片花色苷的全離子 (TIC) 圖

圖10 花色苷的離子掃描結(jié)果

對質(zhì)荷比449.2的母離子進行離子碰撞，顯示其進一步碎裂，產(chǎn)生質(zhì)荷比287.1和288.2 2個最主要的碎片離子(圖11)。結(jié)合前人的研究[12,13]，可以確定RT7.0min的色譜峰為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(圖12)。因此，在離子掃描中，質(zhì)荷比449為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的母離子([M+H]+)，而質(zhì)荷比287離子為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷部分母離子在質(zhì)譜條件下糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生矢車菊素的離子碎片峰([M-Glucose+H]+)。

圖11 質(zhì)荷比449.2母離子的離子碰撞圖

圖12 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的結(jié)構圖

3 討論

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，是一類含脂的色素家族，通過吸收大部分的紅光和紫光，反射綠光，使植物葉片呈綠色。胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，廣泛存在于植物細胞中，在植物器官呈黃色、橙色和紅色等顏色扮演著重要的角色[7,8]。花色苷屬于類黃酮物質(zhì)，廣泛分布于花、莖、葉、果皮等器官的表皮細胞的細胞液之中，并使其呈現(xiàn)出紅色、紫紅色等不同顏色。部分研究認為，彩葉樹種葉片變色過程，是葉綠素不斷降解、花色苷和類胡蘿卜素和一些其他色素不斷累積而共同作用的結(jié)果[7～9]。本研究結(jié)果顯示，山烏桕葉片在轉(zhuǎn)色過程中，葉綠素總體大幅下降；類胡蘿卜素變化較小，且不同的家系變化趨勢不一致，有的家系類胡蘿卜素含量呈下降趨勢，有的家系呈上升趨勢；葉片轉(zhuǎn)色后，各家系花色苷急劇累積。說明山烏桕葉片變紅過程，可能是葉綠素逐漸減少、花色苷逐漸積累的過程，而類胡蘿卜素可能在山烏桕葉片轉(zhuǎn)色過程中作用不大。

本研究對山烏桕葉片中的花色苷進行了分離純化，并對其組分進行了液質(zhì)分析，色譜檢測結(jié)果顯示，其花色苷為單組分；結(jié)合ESI正離子掃描和MS/MS離子碰撞，認為該組分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。近年來，林木遺傳育種已從傳統(tǒng)的選育方法發(fā)展到分子遺傳育種。通過實驗結(jié)果分析，山烏桕葉片在一定條件的環(huán)境脅迫下，激發(fā)能增多矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量的相關基因的表達，導致山烏桕葉色變紅。以此可以推測，若想選育出葉色更紅、或者保持紅葉時期更長的山烏桕品種，應當在花色苷有關基因的表達上進行研究。因此，本研究結(jié)果可為山烏桕的分子育種提供參考。