岳婧怡

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，安徽 蕪湖 241000)

郁陽

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012)

湯強，童傳旺，徐迪，王巨龍

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，安徽 蕪湖 241000)

內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，植物以其內(nèi)真生菌的組織、細胞及其代謝產(chǎn)物為內(nèi)環(huán)境，而內(nèi)生真菌以宿主植物的組織和細胞及其代謝產(chǎn)物為外環(huán)境，兩者之間互相進行物質(zhì)、能量及基因交流，在長期進化過程中與寄主協(xié)同進化，在演化過程中兩者形成了互惠共生關(guān)系。這種關(guān)系決定了內(nèi)生真菌對宿主植物具有促生抗逆(抗干旱、抗病蟲害等)以及有效成分合成積累的獨特生物學特性。目前，已有學者[1～4]從藥用植物內(nèi)生真菌中，篩選分離出大量具有較強抗農(nóng)作物病害活性的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物。從藥用植物內(nèi)生真菌中尋找和發(fā)現(xiàn)抗病原真菌有效活性成分，為新型生物農(nóng)藥的研究和開發(fā)提供了新的途徑。

石斛屬常見病害主要有黑斑病、炭疽病、霜霉病、灰霉病、白絹病[5,6]。其中炭疽病主要病原為膠胞炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，主要為害石斛葉片，也為害莖部，幼苗、成株均可得病；黑斑病病原菌為交鏈孢真菌細極鏈格孢菌Alternariatenuissima，主要為害石斛葉；根腐病主要病原菌為立枯絲核菌Rhizoctoniasolani，主要為害石斛根部，導致根充水腐爛。目前對栽培石斛病害的防治主要依靠化學農(nóng)藥，這必然導致產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢出甚至超標，危害藥材品質(zhì)。本研究通過前期對霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)內(nèi)生真菌進行分離鑒定，分離得到6種內(nèi)生真菌(Alternariaeichhorniae、Colletotrichumorchidophilum、Stagonosporopsisoculihominis、Fusariumlactis、Phyllostictaaristolochiicola、Aspergillusflavus)，并對其進行抗病原真菌活性篩選，篩選得到活性較好的2株內(nèi)生真菌，為后期尋找抗病原真菌(尤其對宿主植物致病真菌)活性先導化合物，揭示內(nèi)生真菌與宿主植物活性成分之間的關(guān)系以及探索新穎的活性化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器與試劑

JJ-CJ-2FD 潔凈工作臺：吳江市凈化設備總廠；MIKRO 22R 高速冷凍離心機：德國Hettick 公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠； DHG-9076A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；所用試劑均為分析純。

1.1.2培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌分離純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)不含抗生素；內(nèi)生真菌發(fā)酵采用馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)。

1.1.3供試菌

霍山石斛內(nèi)生真菌：Fusariumlactis、Phyllostictaaristolochiicola、Stagonosporopsisoculihominis、Alternariaeichhorniae、Aspergillusflavus、Colletotrichumorchidophilum。菌種保存于蕪湖職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院。

植物病原真菌：小麥紋枯菌(Rhizotoniacerealis)、油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)、煙草蛇眼(Cercosporanicotianae)、茄子莖枯菌(Corynesporamelongnae)、玉米圓斑菌(Bipolariscarbonum)、牡丹炭疽菌(Colletotrichumsp.)、茄子棉疫(Phytophthoraparasitica)。7 種植物病原真菌由安徽中醫(yī)藥大學天然藥物化學教研室提供。

石斛病原真菌：立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniCFCC)、極細交鏈孢菌(AlternariatenuissimaCFCC)、膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesCFCC)。3種病原真菌由中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 方法

1.2.1供試菌發(fā)酵液制備

將保存在斜面試管的6種供試菌在無菌環(huán)境下接種于PDA 培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中28℃避光培養(yǎng)5～7d，用打孔器取直徑為6mm 的菌餅接種于盛有200mLPDB 液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，置于28℃搖床(180r/min)培養(yǎng)5～7d 后，減壓過濾，得濾液，即為6種供試菌的發(fā)酵液。取發(fā)酵液，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，得到6種供試菌發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物。取一定量萃取物浸膏置容量瓶中，加入微量的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻，無菌水定容，配制成1mg/mL 濃度藥液。

1.2.2抑菌試驗

采用菌落生長速率法進行。取1mL 供試藥液，實驗前用0.22μm 微孔濾頭濾過，與9mL的PDA 培養(yǎng)基于無菌試管中混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成含藥培養(yǎng)基平板，以DMSO 和無菌水作空白對照。將病原真菌菌種接種于PDA 培養(yǎng)基平板上活化5～7d 后，用無菌打孔器在活化完全的病原真菌菌落邊緣打下6mm 生長一致的菌餅。將打好的菌餅菌絲面向下，接于培養(yǎng)基平板中心，封口，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～10d。每個試驗平行重復3次。

抑菌結(jié)果采用十字交叉法[7]判定。待空白對照菌落長至平板邊緣時，即可測量各培養(yǎng)皿中菌落直徑，以3 次重復菌落直徑的平均值計算菌絲生長抑制率I。

I=[(C-T)/(C-6)]×100%。

式中：C為空白對照菌落生長直徑，mm；T為處理菌落生長直徑，mm；6為菌餅直徑，mm。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，菌種Aspergillusflavus乙酸乙酯萃取液對10種病原真菌抑菌效果最差，Colletotrichumorchidophilum僅比Aspergillusflavus抑菌活性好，其他4種菌種乙酸乙酯萃取液對10種病原菌效果各有優(yōu)劣，其中菌種Stagonosporopsisoculihominis對10種病原真菌平均抑菌率達到50%以上，尤其是對油菜菌核抑菌率高達90%；Alternariaeichhorniae相比其他菌種對3種石斛致病菌都有一定的抑菌率，且高于其他病原真菌抑菌率；Fusariumlactis對立枯絲核病原真菌抑菌率達到了100%；Phyllostictaaristolochiicola對10種病原真菌都具有一定的抑制作用。

表1 6種內(nèi)生真菌對10種植物病原真菌體外抑制率

注：“-”表示染菌嚴重導致無法測得實驗數(shù)據(jù)。

就3種霍山石斛致病菌來說，Alternariaeichhorniae和Colletotrichumorchidophilum對其有廣譜抑菌效果，而Stagonosporopsisoculihominis、Fusariumlactis和Phyllostictaaristolochiicola對其中立枯絲核菌抑菌率都高達70%以上，尤其是Fusariumlactis對其抑菌率為100%。

3 討論

內(nèi)生真菌是一類應用前景廣闊的微生物資源，在探討藥用植物內(nèi)生真菌多樣性的同時，往往能從所分離得到的內(nèi)生真菌中篩選出與宿主植物相似活性(抗菌抗氧化等)或者促生抗逆活性較好的菌株[8～10]。本研究選取了霍山石斛內(nèi)生真菌，對其發(fā)酵液進行抗病原真菌活性試驗研究，綜合篩選出2株廣譜和選擇性抗病原真菌較好的菌株，這為今后尋找抗病原真菌活性分子以及生物型農(nóng)藥的開發(fā)提供參考。