陳婷婷，廖獻杉，曾 蘭，梁榜輝，楊楚儀，吳 瑩，李 璇，歐陽軼強，何 萍，黃 勤*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，南寧 530021； 3.廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，南寧 530021)

大鼠被廣泛應(yīng)用于多種疾病研究的模型，包括心血管領(lǐng)域的研究模型。超聲技術(shù)作為一種無創(chuàng)的檢查方法大量應(yīng)用于臨床，而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，技術(shù)日趨精細(xì)成熟，目前已經(jīng)廣泛使用于動物實驗的觀察研究，可精細(xì)到檢查小動物的內(nèi)臟器官。本研究介紹使用一種新型彩色多普勒超聲診斷儀檢測大鼠心功能的方法，并探討其可行性和準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性8周齡SD大鼠6只，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK (桂) 2014-0002]，潔凈級別為SPF級，體重210～240 g，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK (桂) 2014-0003]，實驗操作在動物中心影像操作室進行，動物實驗經(jīng)由實驗動物管理委員會批準(zhǔn)(201710012)，實驗動物使用按照3R原則給予人道的關(guān)懷照顧。

1.2 主要儀器

小動物麻醉呼吸機，型號為R510IP；意大利百勝MyLabTMSix型彩色多普勒超聲診斷儀，配置有三個探頭，分別為線陣探頭、心臟探頭和腹部(微凸)探頭。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲心動圖檢查

實驗動物稱重后，將大鼠放于麻醉誘導(dǎo)盒中，打開揮發(fā)罐注入一定量的異氟烷，并調(diào)整氧氣流量計，大鼠一般調(diào)整為500～700 mL/min，誘導(dǎo)麻醉時，可將濃度調(diào)至3%～3.5%，待動物完全麻醉(動物身體翻倒為側(cè)姿且并未試著恢復(fù)其臥姿狀態(tài))后(約2～3 min)，調(diào)維持麻醉濃度為2%～2.5%，并將氣體流量閥撥向“Mask”，使氣體流向麻醉面罩，并將大鼠口鼻對準(zhǔn)麻醉面罩，放置于手術(shù)操作臺上，用電動剃須刀剃掉胸毛[1-4]，未剃干凈的毛發(fā)可用脫毛膏進行二次脫毛，使之?dāng)[好左側(cè)臥位，大鼠左側(cè)上下肢均用固定器固定于手術(shù)臺面，右側(cè)上下肢則用固定繩固定于手術(shù)臺架上。打開超聲診斷儀電源，新建病例，根據(jù)需要在LED屏上選擇合適的探頭(被選擇的探頭指示燈亮)，本研究選用的是高頻線陣淺表探頭Biosound SL 2325，探頭頻率為6 MHz～19 MHz，并且注意探頭指示燈在超聲圖上的位置顯示，開始檢查，涂適量耦合劑于探頭上，并將探頭置于左胸前乳頭肌水平，并指向右上(指示燈在下方)，角度為45°，使探頭指示燈與屏幕上的“e”(左)指示一致，并調(diào)整二維超聲圖深度為1.5～2.0 cm，當(dāng)獲得滿意的左心室長軸切面圖時，由二維圖像引導(dǎo)取M型曲線，將M型取樣線置于乳頭肌及心尖等位置，可獲得相應(yīng)的M型曲線，保存圖片，并進行測量左室收縮末期和舒張末期內(nèi)徑、室間隔舒厚度、左室后壁厚度，并計算左室收縮功能指標(biāo)：搏出量、心輸出量、短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)。一般測量3個連續(xù)心動周期取其平均值。檢查結(jié)束后可選擇靜態(tài)存儲和動態(tài)存儲進行圖像的保存，將信息導(dǎo)出到電子設(shè)備作為數(shù)據(jù)儲備。所有實驗操作均經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心批準(zhǔn)，并嚴(yán)格按照實驗動物使用的3R原則給予特定的人道關(guān)懷和照顧。

1.3.2 超聲檢測指標(biāo)

①左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)及左心室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)；②根據(jù)左室內(nèi)徑(D)數(shù)據(jù)，用容量公式V=1.04 × D3計算出左心室收縮末期容積(LVESV)和左心室舒張末期容積(LVEDV)[5]；③每搏輸出量(SV)=LVEDV - LVESV；④左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS)=(LVDd - LVDs)/LVDd × 100%；⑤射血分?jǐn)?shù)(EF)=SV/LVEDV × 100%；⑥心率(HR)；⑦室間隔厚度(IVSTh)。超聲的測量是根據(jù)美國超聲心動圖學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)[6]來執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠心臟超聲心動圖表現(xiàn)

由左室長軸切面圖可以清晰地顯示出左室腔近似橢圓形，可以清楚地顯示出左室前后壁、心內(nèi)膜、心外膜以及主動脈和主動脈瓣，二維圖像引導(dǎo)的M型圖像，見圖1。通過此圖像可以測定大鼠各項參數(shù)，并計算心臟的收縮功能，見表1。

3 討論

已有研究[7-8]表明，二維超聲及M型超聲心動圖是公認(rèn)無創(chuàng)檢查心臟結(jié)構(gòu)和功能的比較理想的方法。由于鼠科動物的胸壁隆起，心臟體積小，傳統(tǒng)的低頻(3.5 MHz～5 MHz)超聲是不能獲得較清晰的圖像的，而如今隨著超聲技術(shù)的不斷發(fā)展，7.5 MHz～12 MHz的高頻探頭的應(yīng)用[9-10]，可以使得圖像清晰度升高，并且分辨率也得到提升，這為超聲的診斷提供了更多的機會。由于科研的發(fā)展需要，目前已有多種專門應(yīng)用于動物研究的超聲診斷儀，進一步表明超聲診斷在動物研究中的重要性，近年已大量應(yīng)用于心衰[11]、高血壓[12]及糖尿病心肌病等[13-14]的輔助診斷。

注：圖中IVS所示為室間隔，LV表示左心室，LA表示左心房，AO表示主動脈圖；圖中Dd箭頭所示為左室舒張末期內(nèi)徑，Ds箭頭所示為左室收縮末期內(nèi)徑，IVSTh箭頭所示為室間隔厚度。圖1 正常大鼠心臟二維及M型超聲心動圖Note. In the figure, IVS is the ventricular septum, LV is the left ventricle, LA is the left atrium, AO is the aortic view; the Dd arrow indicates the left ventricular end diastolic diameter, the Ds arrow indicates the left ventricular end systolic diameter, and the IVSTh arrow indicates the septal thickness.Figure 1 Two-dimensional and M-mode echocardiography of the normal rats

指標(biāo)Indices均值±標(biāo)準(zhǔn)差Mean±standard deviation95%可信區(qū)間95% confidence intervalLVDd(mm)5.522±0.2265.284～5.759LVDs(mm)2.775±0.3162.443～3.107LVEDV(mL)0.177±0.0220.154～0.199LVESV(mL)0.023±0.0100.013～0.034SV(mL)0.154±0.0190.134～0.174CO(mL)0.047±0.0070.040～0.054EF(%)86.940±4.03382.710～91.180FS(%)49.710±5.20044.260～55.160IVSTh(mm)1.377±0.1371.233～1.521HR(bpm)318.934±39.475269.920～367.948

注：LVDd：左室舒張末期內(nèi)徑，LVDs：左室收縮末期內(nèi)徑，LVEDV：左室舒張末容積，LVESV：左室收縮末容積，SV：每搏輸出量，CO：心排血量，EF：射血分?jǐn)?shù)，F(xiàn)S：短軸縮短率，IVSTh：室間隔厚度，HR：心率。

Note. LVDd: left ventricular end diastolic diameter, LVDs: left ventricular end systolic diameter, LVEDV: left ventricular end diastolic volume, LVESV: left ventricular end systolic volume, SV: stroke volume; CO: cardiac output, EF: ejection fraction, FS: short axis shortening rate, IVSTh: septal thickness, HR: heart rate.

本實驗中，本課題組應(yīng)用一種新型的彩色多普勒超聲診斷儀。該儀器最適用于檢測中型動物的內(nèi)臟器官，具有快速精確、高度靈活的增強型超聲系統(tǒng)，由于它可提供各式各樣的換能器(二維和三維)，因此可使用在心血管及其它各系統(tǒng)常規(guī)成像，包括從腹部小器官和乳腺影像到肌肉骨骼、心臟及婦科和產(chǎn)科應(yīng)用。目前應(yīng)用于心功能檢測的超聲類型主要包括M型超聲心動圖[15-16]、二維超聲心動圖[17-19]、三維超聲心動圖[20]及組織多普勒超聲心動圖[21-24]幾種類型，已經(jīng)大量用于臨床及科研研究。

大鼠是常用的科研動物模型，本研究使用了一種新型超聲診斷儀來探究大鼠的心功能測定。由于大鼠心臟體積小、心率快(人心率的4倍)及胸壁突起的特點，若使用凸陣探頭，不能清楚地顯示出心臟四腔切面和組織多普勒圖。文獻報道，高頻線性探頭可用于大鼠心臟結(jié)構(gòu)的檢查[4, 25]，獲得清晰的圖像和參數(shù)。因此，本課題組選擇嘗試用新型超聲儀的線陣探頭檢測大鼠的心臟，獲得了高清的大鼠心臟結(jié)構(gòu)圖(見圖1)。檢測過程中，保證每一次大鼠所擺的體位和探頭位置一致，將大鼠四肢均固定在操作臺上，操作者手法穩(wěn)定，保證探頭的位置和角度保持一致，可獲得多項穩(wěn)定的心功能數(shù)據(jù)(表1)。結(jié)果證明，它能夠滿足科研實驗中檢測大鼠心臟大體結(jié)構(gòu)和功能評價的需要，且操作方便快捷。

根據(jù)本研究結(jié)果總結(jié)經(jīng)驗，實驗檢測中要注意如下幾點：①麻醉要適度。麻醉過淺會導(dǎo)致大鼠亂動，心率波動大，并且體位改變，不能快速獲得測量結(jié)果，并且大鼠受刺激使得心功能變化，結(jié)果誤差大；麻醉過深可造成大鼠心率過低，影響實驗結(jié)果，嚴(yán)重的可造成大鼠死亡，本課題組使用小動物麻醉呼吸機嚴(yán)格控制誘導(dǎo)麻醉濃度及維持麻醉濃度，選用的是麻醉并發(fā)癥少、死亡率低，適用于各種動物的國際認(rèn)可麻醉劑異氟烷[26-27]，以避免大鼠因麻醉造成的對實驗的不利因素。注意用異氟烷麻醉若需長時間麻醉，則需將大鼠放置于保溫墊上維持體溫。麻醉前空腹8 h以免食物引起窒息及影響藥效。②大鼠胸部的毛必須剔除干凈，否則毛發(fā)會影響觀察，本研究嘗試過脫毛膏、剪毛及電動剃須刀三種方法，電動剃須刀效果最好，注意不要剃傷大鼠。麻醉使大鼠安靜下來之后，再進行剃毛和超聲檢查。③體位擺放、探頭的位置和方向均要保持固定一致，才能獲得穩(wěn)定和精確的數(shù)據(jù)，避免人為因素造成的誤差。④為獲得更清晰的圖像和更精確的數(shù)據(jù)，盡量選擇頻率大的探頭進行檢測。⑤操作者手法要穩(wěn)定柔和，要有足夠的耐心。

總的來說，使用該新型超聲診斷儀可無創(chuàng)、連續(xù)和準(zhǔn)確檢測大鼠心臟功能各項功能參數(shù)，并得到心室大體結(jié)構(gòu)的清晰圖像。與其它有創(chuàng)性心功能檢查(包括心血管造影檢查、在體心臟插管血流動力學(xué)、離體心臟灌流檢測等)相比，本實驗方法的優(yōu)勢在于無創(chuàng)傷、無痛苦，操作簡單快捷，大鼠死亡率低，并且其數(shù)據(jù)導(dǎo)出功能強大，可導(dǎo)出到PC(Windows?、MAC?)和各種移動設(shè)備(平板電腦、智能手機)，為研究者提供方便。此外，與其他無創(chuàng)性心功能檢查(心電圖、頸動脈搏動圖等)相比，本實驗應(yīng)用的新型超聲診斷儀可以獲得更直觀的心臟結(jié)構(gòu)圖像結(jié)果，得到的數(shù)據(jù)更多，可更全面判斷心功能情況。

該儀器也有一定的局限性。使用超聲診斷儀的凸陣探頭時，頻率較低，而大鼠體積偏小，不能獲得滿意的心臟四腔切面，需要選擇淺表探頭，在左室長軸切面及M型曲線上測量，才能得到滿意的精確數(shù)據(jù)。另一方面，因為大鼠心率很快，而多普勒超聲掃描速度有限，E峰和A峰融合，無法準(zhǔn)確判斷出舒張期血流速度E峰和A峰的位置，即不能準(zhǔn)確記錄心臟舒張期血流情況，說明這臺儀器在檢測大鼠心臟舒張功能時需要注意選擇合適的檢測指標(biāo)，應(yīng)使用其它指標(biāo)綜合分析舒張功能。此外，該儀器可用于大鼠及更大的動物，如果想要檢測小鼠的心功能，則需要使用更靈敏和更精確的小型動物超聲儀。目前現(xiàn)有的經(jīng)典小動物超聲儀，如Vivo2100彩色多普勒超聲儀，與本實驗超聲診斷儀相比，具有更高頻率(40 MHz)，它采用的是256振元電子線陣探頭技術(shù)，并且實時心臟圖像采集頻率最高可達1000幀/s，能實時連續(xù)顯示心動周期內(nèi)心臟各部位的形態(tài)學(xué)改變。已有研究表明[28]，Vivo2100彩色多普勒超聲儀可用于診斷大小鼠心血管疾病密切相關(guān)的血流速度和方向等的測量，可清晰獲得心臟四腔及五腔切面圖，獲得準(zhǔn)確的冠脈血流參數(shù)，為臨床診斷血管疾病提供一定的參考。因此，相比之下本實驗所應(yīng)用的超聲診斷儀是具有一定局限性的，實驗者需根據(jù)實驗條件及需求選擇合適的儀器。