李建瑛，肇寅輝，康 燕，張東輝，許 琴，董 翔，李佳佳，是文輝，馬 娜，沈才福，劉江偉*

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000； 2.解放軍69240部隊(duì)醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

中暑是以核心體溫升高的并伴有一系列癥狀的致命性疾病，主要表現(xiàn)為核心體溫升高(≥ 41℃)，中樞神經(jīng)癥狀，肝腎功能受損等，嚴(yán)重者可表現(xiàn)為多器官衰竭綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome)[1 - 2]。中暑在南方多發(fā)生于濕熱環(huán)境，而我國西北部夏季炎熱干燥且分布大面積沙漠，在干熱環(huán)境下中暑具有體液大量丟失，循環(huán)衰竭，器官缺血缺氧嚴(yán)重等特點(diǎn)。干熱環(huán)境下機(jī)體體液丟失，循環(huán)血流重新分布，腎血流減少，腎細(xì)胞缺血缺氧以及高熱對細(xì)胞的直接損傷，造成細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量堆積，氧化應(yīng)激失衡[3]。

姜黃素作為一種細(xì)胞抗氧化劑，對腦、心、肝、腎等重要臟器均能起到保護(hù)作用。有實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素可使異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心電圖缺血性改變減輕，抑制血清肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的升高以及血清游離脂肪酸升高，同時還可以降低缺血心肌丙二醛的含量[4]。我們前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)姜黃素能提高沙漠干熱環(huán)境大鼠的生存時間[5]，因此我們推測，姜黃素對于干熱環(huán)境下大鼠腎損傷具有保護(hù)作用。本研究通過復(fù)制干熱環(huán)境大鼠中暑模型，觀察姜黃素預(yù)處理對于不同程度大鼠中暑模型腎病理變化以及氧化應(yīng)激水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

80只6～8周齡的SPF級雄性SD大鼠(190～220 g)，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK (新) 2016-0003]。飼養(yǎng)于溫度(25±2)℃的SPF級動物實(shí)驗(yàn)室中，12 h白天與黑夜循環(huán)，飼料與水充足供應(yīng)[SYXK (新) 2016-0003]。隨機(jī)分為2組(n=40)：鹽水對照組以及姜黃素預(yù)處理組。每組下分為4個亞組(n=10)：干熱0 min組(即常溫組)，干熱50 min組(輕度中暑組)，干熱100 min組(中度中暑組)，干熱150 min組(重度中暑組)。鹽水組大鼠給予0.9%生理鹽水灌胃，姜黃素組大鼠給予200 mg/kg姜黃素+ 5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；各組大鼠均連續(xù)灌胃7 d。0 min組置于常溫環(huán)境中[溫度(25±2)℃，相對濕度(35±5)%]，其余組在西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)設(shè)置的干熱環(huán)境[(41±0.5)℃，濕度(10±1)%]中復(fù)制不同程度的大鼠中暑模型[6]。在相應(yīng)時間麻醉大鼠并處死大鼠，下腔靜脈采血，取一部分腎組織于10%甲醛溶液，另一部分于液氮中凍存。動物實(shí)驗(yàn)方案符合新疆軍區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會管理要求，按3R原則給予人道關(guān)懷，批準(zhǔn)文號為DWLL2018001。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素由東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMCNa)中使用；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)以及丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒購自Thermo Fisher公司。全自動生化檢測儀(BS-180)(中國邁瑞公司)；光學(xué)顯微鏡CKX41(日本Olympus)；TS-12U生物組織脫水機(jī)(中國亞鵬)；LEICA RM213型組織切片機(jī)(德國)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技公司)；YB-6D型生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北孝感亞光電子技術(shù)公司)。

注：與鹽水組相同時間點(diǎn)比較，#P< 0.05，## P< 0.01。圖1 各時間點(diǎn)血清肌酐、尿素氮的變化Note. Compared with the saline control group at the same time,#P< 0.05,## P< 0.01.Figure 1 Changes in the serum creatinine and urea at various time points

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清肌酐、尿素氮檢測

在相應(yīng)時間點(diǎn)3%戊巴比妥麻醉麻醉大鼠，下腔靜脈收集血液，3000 r/min離心10 min，取血清，全自動生化分析儀進(jìn)行肌酐及尿素氮含量檢測。

1.3.2 腎病理學(xué)檢測

取大鼠腎組織于10%中性甲醛中固定，脫水、石蠟包埋，切片，脫蠟，HE染色，并在雙盲的條件下閱片，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變，在400倍視野下連續(xù)觀察100個不同視野，進(jìn)行Paller’s評分[7]：每個高倍鏡視野隨機(jī)選擇10個有病變的腎小管，按100個腎小管記分，標(biāo)準(zhǔn)：腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平為(1)分；刷狀緣損傷(1)分，脫落為(2)分；管型(2)分，腎小管管腔內(nèi)有脫落的、壞死的細(xì)胞(未成管型或細(xì)胞碎片)計(jì)(1)分。

1.3.3 腎組織中SOD、CAT及MDA活性的檢測

取0.1 g凍存腎組織，置于玻璃勻漿器中研磨至無塊狀，加入900 μL PBS溶液，12 000 r/min離心10 min取上清，分裝進(jìn)行SOD、CAT及MDA含量檢測。SOD由黃嘌呤氧化酶法檢測，單位為U/mg pro；CAT由可見光法檢測，單位為U/mg pro；MDA由硫代巴比妥法檢測，單位為mmol/mg pro。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清中肌酐、尿素氮含量

如圖1所示，在持續(xù)干熱環(huán)境下50 min、100 min以及150 min經(jīng)姜黃素預(yù)處理的大鼠血清肌酐含量明顯低于鹽水組，差異有顯著性(P< 0.05，P< 0.01)，血清尿素氮含量呈現(xiàn)相同趨勢，但在干熱環(huán)境50 min時，姜黃素組尿素氮含量較鹽水組也有所下降，但差異無顯著性(P> 0.05)，在100 min和150 min時，姜黃素組尿素氮明顯低于鹽水組，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.2 腎組織病理學(xué)變化

干熱環(huán)境50 min時鹽水組腎病理變化表現(xiàn)為腎小球囊腔變窄，輕微充血，腎小管上皮細(xì)胞水腫，部分細(xì)胞脫落；姜黃素預(yù)處理組可見腎病理變化較鹽水組減輕。干熱100 min時鹽水組病理變化進(jìn)一步加重，可見腎小球囊腔消失，腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變，水腫，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞脫落；姜黃素預(yù)處理組腎小球囊腔狹窄但未消失，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔內(nèi)少量脫落細(xì)胞碎片。150 min時可見腎小球充血、水腫，腎小管內(nèi)可見管型形成；姜黃素預(yù)處理組，可見腎小球充血，腎小管內(nèi)大量脫落細(xì)胞但未形成管型。經(jīng)姜黃素預(yù)處理腎組織病理變化呈現(xiàn)不同程度的減輕，見圖2。病理損傷Paller’s評分結(jié)果：在同一時間點(diǎn)，姜黃素預(yù)處理組腎損傷病理評分明顯低于鹽水組，差異有顯著性(其中50 min和100 min組P< 0.05，150 min組P< 0.01)，見圖3。

注：A1：50 min鹽水組；A2：50 min姜黃素預(yù)處理組；B1∶100 min鹽水組；B2∶100 min姜黃素預(yù)處理組；C1∶150 min鹽水組；C2∶150 min姜黃素組。圖2 腎病理組織學(xué)變化(HE染色，× 200)Note. A1: 50 min saline group; A2: 50 min curcumin pretreatment group; B1: 100 min saline group; B2: 100 min curcumin pretreatment group; C1: 150 min saline group; C2∶150 min curcumin pretreatment group.Figure 2 Renal histopathological changes. HE staining

2.3 腎組織中SOD、CAT、MDA活性

鹽水組以及姜黃素組中腎組織勻漿中SOD以及CAT的活性隨著干熱環(huán)境持續(xù)時間的延長均呈現(xiàn)下降趨勢，相反MDA呈現(xiàn)上升趨勢。在同一時間點(diǎn)經(jīng)姜黃素預(yù)處理大鼠的腎組織中SOD、CAT活性較鹽水組升高，除了CAT在100 min組外，其余各組差異均有顯著性(P< 0.05)。而MDA的含量經(jīng)姜黃素預(yù)處理后在各個時間點(diǎn)均較鹽水組明顯下降(P< 0.05)。見圖4。Spearman相關(guān)性分析提示，MDA與腎小管損傷的Paller’s評分呈正相關(guān)(r=0.75，P< 0.01)。

3 討論

注：與鹽水組相同時間點(diǎn)比較，#P< 0.05，## P< 0.01。圖3 腎損傷Paller’s評分的變化Note. Compared with the saline control group at the same time,#P< 0.05,##P< 0.01.Figure 3 Changes in Paller’s scores of the renal injury

腎是中暑時的常見受累器官之一，前期研究表明干熱環(huán)境下腎呈現(xiàn)充血，管型形成等病理變化[6]。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制干熱環(huán)境下不同程度大鼠中暑模型，觀察姜黃素預(yù)處理與相應(yīng)鹽水對照組之間腎病理學(xué)變化以及腎組織氧化應(yīng)激水平的變化。本研究發(fā)現(xiàn)干熱環(huán)境下，腎呈現(xiàn)相似病理變化，并且隨著干熱環(huán)境持續(xù)時間的延長而加重。中暑被認(rèn)為是劇烈的失控性炎癥反應(yīng)[8]，中暑損傷主要是由于核心體溫過高對細(xì)胞產(chǎn)生熱損傷作用，引起細(xì)胞膜損傷、線粒體功能障礙和有氧代謝途徑中斷，被激活的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞甚至內(nèi)皮細(xì)胞均可產(chǎn)生大量的氧自由基[9]。氧化應(yīng)激是機(jī)體正常的氧化和抗氧化失衡所致[10]，氧化應(yīng)激與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]，熱應(yīng)激引起的大量氧自由基釋放可造成細(xì)胞內(nèi)氧化以及抗氧化失衡，引起細(xì)胞損傷。SOD與CAT是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的重要抗氧化酶，在本實(shí)驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)隨著干熱環(huán)境的延長腎組織中SOD與CAT的活性逐漸下降，而細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA初步上升，且MDA與腎小管損傷的Paller’s評分呈正相關(guān)(r=0.75，P< 0.01)。由此可見，腎組織的氧化應(yīng)激水平升高可能是干熱環(huán)境下腎損傷的機(jī)制之一。在本研究中，在干熱環(huán)境50 min、100 min以及150 min姜黃素組的肌酐與尿素氮值均較鹽水組有所下降，說明姜黃素對于干熱環(huán)境下大鼠的腎功能具有一定的保護(hù)作用。同時我們也發(fā)現(xiàn)，姜黃素預(yù)處理組腎組織中的SOD、CAT活性較鹽水組明顯提高，而腎組織MDA含量較鹽水組下降,表明姜黃素在沙漠干熱環(huán)境中對腎組織發(fā)揮抗氧化作用。

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取出的一種天然藥物，呈黃色，是姜黃的主要活性成分。目前研究普片認(rèn)為姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，并且具有安全高效等特點(diǎn)，是近年來國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。姜黃素還可以通過清除自由基和增強(qiáng)抗氧化酶活性來實(shí)現(xiàn)其抗氧化功能[12]。一些動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以對糖尿病腎病以及人為誘導(dǎo)的急性腎損傷具有保護(hù)作用，其中均發(fā)現(xiàn)，姜黃素可提高腎組織內(nèi)CAT、SOD的活性，同時降低MDA的活性，說明姜黃素抗氧化的機(jī)制可能與提高組織內(nèi)抗氧化酶的活性有關(guān)[13-16]。

本實(shí)驗(yàn)將姜黃素預(yù)處理大鼠，進(jìn)行干熱環(huán)境下不同程度中暑大鼠腎損傷的保護(hù)作用的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素預(yù)處理對于干熱環(huán)境下不同程度中暑的大鼠模型腎損傷均具有預(yù)防保護(hù)作用，其機(jī)制可能部分通過姜黃素的抗氧化作用而發(fā)揮腎保護(hù)作用。姜黃素作為傳統(tǒng)藥物，具有高效、副作用小等特點(diǎn)，在沙漠干熱環(huán)境下預(yù)防腎損傷具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

注：與鹽水組相同時間點(diǎn)比較，#P< 0.05。圖4 腎組織中SOD、CAT以及MDA在不同時間的變化 Note. Compared with the saline control group at the same time,#P< 0.05.Figure 4 Changes of SOD, CAT, and MDA in the renal tissues at various time points