范凱健，吳 菁，王婷玉*

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科，上海 200011； 2.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結合醫(yī)院藥劑科，上海 201901)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、進行性的自身免疫系統(tǒng)疾病，其特征主要是滑膜的長期慢性炎癥，從而造成軟骨以及骨關節(jié)結構的逐漸破壞。RA影響超過1%的人群，并導致患者的生活質量明顯下降[1]。RA具有多樣的臨床癥狀，因此許多實驗動物模型試圖模仿這種疾病的多種臨床特征。目前，研究者已經開發(fā)了許多關節(jié)炎模型，并且這些模型成為闡明RA疾病發(fā)展過程和開發(fā)新藥的非常有用的工具[2-4]。許多轉基因小鼠需要在C57BL/6小鼠背景下繁殖，因此在此小鼠背景下的疾病造模研究就顯得尤為重要。轉基因小鼠的研究將更廣泛地揭示疾病的分子機制，并且能為可能的治療方法提供驗證。本實驗將研究C57小鼠背景下，膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)和抗原誘導的關節(jié)炎(antigen-induced arthritis，AIA)的造模情況。

注：A：兩側股骨頭對應的外部皮膚皮內注射；B：膝關節(jié)腔內注射。圖1 AIA模型造模注射部位Note. A: Intradermal injection to the external skin corresponding to the femoral head on both sides. B: Intra-articular injection of the knee joint.Figure 1 Injection sites for modeling of the AIA model

1 材料和方法

1.1 實驗動物

AIA組8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠(體重：20～25 g)21只，CIA組10～14周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠(體重：25～30 g)21只，由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物房所提供[SCXK (滬) 2013-0016]。常規(guī)飼養(yǎng)于擁有獨立通氣籠盒(individual ventilated cages，IVC)的動物房，12 h光照和夜循環(huán)，溫度(22±2)℃，濕度50%～60%[SYXK (滬) 2016-0016]。實驗期間，遵循3R原則給予實驗動物人道主義關懷。動物實驗的開展取得了上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(編號：HKDL[2017]207)。

1.2 主要試劑與儀器

4 mg/mL雞II型膠原,Chondrex公司，批號170376；5 mg/mL(Chondrex公司，批號170670)和10 mg/mL(Chondrex公司，批號170666)的完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)；冰醋酸溶液；甲基化的牛血清白蛋白(methylated bovine serum albumin,mBSA)；磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS)。游標卡尺(無錫錫豐有限公司)，電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)，微量進樣器(上海高鴿工貿有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 AIA造模方法

選用8周齡雄性C57BL/6小鼠在第0天時，將100 mg mBSA溶解于50 μL PBS中，再與50 μL CFA混合乳化，最后在兩側股骨頭對應的外部皮膚皮內注射(圖1A)。在第7天時，同樣的劑量在尾根部皮內多點注射。在第21天時，將10 μg mBSA溶于5 μL PBS中后注射于左側膝關節(jié)腔內，右側膝關節(jié)腔內則注射同等劑量的PBS(圖1B)。

1.3.2 CIA造模方法

選用10～14周齡雄性C57BL/6小鼠，將4 mg/mL雞的II型膠原冰醋酸溶液，與6.67 mg/mL的CFA按照1: 1混合乳化后分別在第0天和第14天于小鼠尾根部皮內多點注射0.1 mL。

1.3.3 膝關節(jié)、踝關節(jié)的腫脹度和體重的監(jiān)測

對于CIA模型，從第0天開始，用電子稱對小鼠進行稱重，用游標卡尺測量踝關節(jié)和膝關節(jié)的直徑，每周測量兩次，一共測量四周。對于AIA模型，從第0天開始，用電子稱對小鼠進行稱重，用游標卡尺測量膝關節(jié)的直徑，連續(xù)測量一周。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 CIA模型

表1 CIA與AIA模型造模比較

從圖2A可以看出，模型組相對于正常組，體重會明顯減輕，且在第7、12和17這三天的結果差異有顯著性。在此次實驗中，正常組3只，模型組18只(表1)。模型組中5只出現(xiàn)嚴重關節(jié)炎癥狀，2只出現(xiàn)輕微關節(jié)炎癥狀，1只第一次造模后死亡。5只出現(xiàn)嚴重關節(jié)炎癥狀的小鼠中，只有1只四肢都出現(xiàn)嚴重的關節(jié)炎癥狀。從圖2C可以看出，第7天開始，模型組小鼠踝關節(jié)開始出現(xiàn)關節(jié)炎癥狀，且在第17天達到高峰后慢慢減輕。從圖2B可以看出，模型組與正常組膝關節(jié)的差異不明顯，只有在第20天才出現(xiàn)明顯差異。綜上，CIA模型關節(jié)炎癥狀最先累及踝關節(jié)(圖3)，后遷延至膝關節(jié)，且癥狀持續(xù)時間較久。

注：A：體重；B：膝關節(jié)腫脹度；C：踝關節(jié)腫脹度。與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖2 CIA模型組與正常組比較Note. A: Body weight. B: Swelling degree of the knee joint. C: Swelling degree of the ankle joint. Compared with the normal group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 2 Comparison of the CIA model and normal groups

圖3 CIA模型造模成功后小鼠后爪Figure 3 Mouse hind paw after successful CIA model establishment

2.2 AIA模型

從圖4A可以看出，模型組與正常組體重差異無顯著性。在此次實驗中，正常組3只，模型組18只(表1)。其中模型組10只出現(xiàn)嚴重的關節(jié)炎癥狀，7只出現(xiàn)輕微的關節(jié)炎癥狀，1只加強造模前死亡。圖4B可以看出，模型組從第1天開始出現(xiàn)嚴重的關節(jié)炎癥狀，直至第3天開始慢慢消退。從圖4C可以看出，模型組注射PBS的右膝關節(jié)與正常組無明顯差別。綜上，AIA模型關節(jié)炎癥狀主要是在膝關節(jié)(圖5)，且維持較短。

注：A：體重；B：膝關節(jié)腫脹度(左)；C：膝關節(jié)腫脹度(右)。與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。圖4 AIA模型組與正常組比較Note. A: Body weight. B: Swelling degree of the knee joint (left). C: Swelling degree of the knee joint (right). Compared with the normal group,*P < 0.05,**P < 0.01.Figure 4 Comparison of the AIA model and normal groups

圖5 AIA模型造模成功后膝關節(jié)Figure 5 Knee joint after successful AIA model establishment

3 討論

CIA是在1980年首次由CII誘導的小鼠模型[5]，從此成為關節(jié)炎中使用最廣泛的關節(jié)炎模型之一。通過免疫接種，在遺傳易感性小鼠品系中極易引發(fā)CIA。在CIA模型中，小鼠會出現(xiàn)與RA相似的慢性骨侵蝕和滑膜炎癥[5]。但該模型與RA之間最顯著的差異在于CIA中不存在類風濕因子，且實驗性疾病一般是單相的。CIA經典模型是DBA/1(H-2q)小鼠品系，在我們團隊以前的實驗中此品系小鼠造模成功率100%。本實驗中，我們是在C57BL/6背景下造CIA模型。由于B6小鼠的主要組織相容性(major histocompatibility，MHC)的特異性，導致較低的發(fā)病率和較高的差異性[6]。對于在B6背景下CIA造模的研究，國外已經有多支團隊研究過。在Ikic[7]等人的實驗中，是選用的8～10周齡小鼠且加強注射選在第21天，加強時選用不完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，IFA)而非CFA。他們通過對大約200只小鼠造模，研究發(fā)現(xiàn)，造模成功率在50%左右。在我們團隊的實驗中，B6小鼠的造模成功率是41%，與國外團隊成功率差不多，但還是遠低于DBA小鼠的造模成功率。且B6小鼠的關節(jié)炎嚴重程度差異性大，一般只有后爪腫脹，而在DBA背景下造模，基本都會出現(xiàn)四肢嚴重的關節(jié)炎癥狀。由此可見，B6背景下的CIA造模差異性較大，無法出現(xiàn)比較一致的關節(jié)炎癥狀。

AIA是通過mBSA免疫動物并局部誘發(fā)關節(jié)炎的產生。它是一種由T細胞介導的關節(jié)炎癥，其受累關節(jié)的組織病理學與RA有許多相似之處。但由于炎癥局限在膝關節(jié)周圍，AIA并不是RA的一個完整模型。由于組織學的差異性，AIA引起的炎癥相對于RA引起的滑膜炎癥，炎癥過程更加快速但結締組織也更快速的分解[8]。在本次實驗中，膝關節(jié)從第一天開始就出現(xiàn)嚴重的關節(jié)炎癥狀，并持續(xù)三天，后癥狀逐漸減輕。在此次實驗中，AIA的造模成功率為100%，明顯高于CIA的造模成功率。mBSA是一種高密度陽離子蛋白質，能被軟骨表面所吸附，因此可以延長其關節(jié)炎癥狀[9]。此外，膝關節(jié)腔內有限的空間也能導致mBSA誘發(fā)嚴重的關節(jié)炎。綜上，B6背景下的AIA造模成功率高，嚴重程度高，但關節(jié)炎癥狀維持時間短，不利于研究RA的慢性關節(jié)炎機制。雖然AIA模型不是RA的完整模型，但對研究關節(jié)炎局部細胞之間的相互作用還是很有價值的[10]。

在B6背景下，CIA的造模成功率低，且差異性較大，但后爪關節(jié)炎癥狀嚴重且維持時間久。CIA模型在免疫學和病理學上更類似于RA，因此適合研究RA對機體整體的影響。而AIA作為單側關節(jié)炎。優(yōu)點是關節(jié)炎的確切起點，100%的發(fā)生率和重現(xiàn)性好。因此AIA模型適合于關節(jié)疼痛的研究。兩種模型之間各有優(yōu)缺點，適合不同的實驗需求。通過對B6背景下兩種模型的相互比較，為了更全面的研究RA的致病機制，可能更適合在后續(xù)的轉基因小鼠身上造CIA模型。