楊 蕙，孟 盼，楊 琴，韓遠山，凌 佳，杜 青，趙洪慶，王宇紅*

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室，長沙 410007； 2.湖南中醫(yī)藥大學中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，長沙 410208； 3.湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙 410006)

乳腺癌是世界范圍內最常見的女性惡性腫瘤[1]，且比其他類型的癌癥更加能影響患者的精神與情緒[2]。Shakeri等[3]對乳腺癌患者測評后發(fā)現，高達有69.4%的患者表現出了重度抑郁癥。而在中國，調查顯示乳腺癌術后發(fā)生抑郁癥的比例為23.4%，其中重度抑郁癥比例達25%[4]。抑郁癥可嚴重影響乳腺癌的治療及預后[5]，開展乳腺癌并發(fā)抑郁癥(breast cancer related depression，BCRD)的防治研究已迫在眉睫。但是文獻調研后發(fā)現，目前有關BCRD的研究主要集中在臨床，而動物實驗研究少見，嚴重阻礙了BCRD相關研究的進展。本實驗擬采用4T1炎性乳腺癌細胞接種聯合21 d皮質酮注射，建立乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠模型。并通過對比抑郁癥小鼠和乳腺癌小鼠，從行為學、瘤形態(tài)和標記物含量等角度，對該模型進行初步評價，以期為乳腺癌并發(fā)抑郁癥實驗研究提供可靠的動物模型參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c雌性小鼠40只，4～6周齡，18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK (湘) 2013 - 0004，合格證號：43004700025656。動物自購買之日起即飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF動物房內[SYXK (湘) 2015-0003]，并在光暗周期為12 h/12 h環(huán)境中適應性喂養(yǎng)5 d，溫度為20℃～26℃，濕度為40%～70%，自由獲取食物與水。

1.2 主要試劑與儀器

皮質酮購自索萊寶生物公司；RPMI培養(yǎng)基、胰酶購自HyClone；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMSO購自上海藍潤化學有限公司；腫瘤抗原CA153、糖類抗原CA125、癌胚抗原(CEA)、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)的ELISA試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。自動雙重水蒸餾器購自上海健強玻璃儀器有限公司；MK3型酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 4T1炎性乳腺癌細胞的培養(yǎng)

4T1炎性乳腺癌元代細胞株購買于上?？茖W院細胞庫，在顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，用0.22 μm過濾器過濾細胞，棄掉培養(yǎng)液，加入適量PBS輕輕吹打細胞，1500 r/min，8 min離心，加入含有RPMI培養(yǎng)液(內含10%胎牛血清，1%雙抗)10 mL，轉移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 d后，觀察細胞生長狀態(tài)，若長至80%～90%，棄去培養(yǎng)液，用適量PBS洗1次，棄PBS，加入2 mL胰酶，使其與培養(yǎng)板細胞充分接觸，培養(yǎng)箱中消化2 min后，顯微鏡下觀察細胞消化情況，若大部分細胞未變圓，用移液槍輕輕吹打細胞，使80%～90%細胞消化，加入2倍胰酶體積的培養(yǎng)液終止消化，將細胞轉移至5 mL離心管中，1500 r/min，8 min，4℃離心，棄去培養(yǎng)液，加入適量PBS輕輕吹打細胞，使其完全成細胞懸浮狀態(tài)，1500 r/min，8 min，4℃離心，棄PBS，加入培養(yǎng)液，將細胞濃度調整為106個/mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數期時，將細胞消化收集，用PBS將細胞吹打成單個懸浮狀態(tài)，并將其濃度調整為107個/mL。

1.3.2 動物模型制備

以BALB/c小鼠為造模對象，在其腋下接種0.1 mL的107個/mL 4T1炎性乳腺癌細胞，用以建立乳腺癌小鼠模型。采用背部皮下注射皮質酮混懸液30 mg/kg(每300 mg皮質酮用5 mL DMSO預溶解，隨后加入95 mL生理鹽水)，連續(xù)注射21 d，用以制備抑郁癥小鼠模型。而乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠模型則是在接種4T1炎性乳腺癌細胞7 d后，在其背部皮下注射皮質酮混懸液，連續(xù)注射21 d。實驗中全程按照實驗動物使用3R原則給予人道主義關懷，IACUC號：HN-LL-KY-2016-004-01。

1.3.3 動物分組

小鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，將動物按體重隨機分為2組：一組腋下接種4T1炎性乳腺癌細胞，成模的小鼠按糖水消耗隨機分為2組：乳腺癌組和乳腺癌并發(fā)抑郁癥組，未注射4T1炎性乳腺癌細胞的小鼠按糖水消耗分為2組：空白組和抑郁癥組，每組10只。

1.3.4 瘤重、瘤體積指標檢測

小鼠禁食禁水24 h后處死，將乳腺腫瘤剝離下來，并去除多余的毛發(fā)，稱量其瘤重，抑瘤率=(對照組平均質量-實驗組平均質量)/對照組平均質量× 100%。并用游標卡尺量取其長、寬、高三徑，計算體積V=(長×寬2)/2。

1.3.5 行為學檢測

(1)糖水偏好：糖水偏好度反應了抑郁動物快感缺失的癥狀。將小鼠飼養(yǎng)于單籠內，禁食禁水12 h后，給予事先稱好質量的1%蔗糖水和蒸餾水各一瓶，1 h后取出水瓶，稱量出剩余的蔗糖水與蒸餾水的重量。糖水消耗總共測量4次，時間分別為抑郁造模前，造模后1、2、3周。糖水消耗度=糖水消耗量/(蒸餾+糖水消耗量)× 100%。

(2)曠場實驗：小鼠禁食不禁水24 h后，將動物放入箱內底面中心，實驗箱規(guī)格為50 cm × 50 cm × 40 cm。適應30 s后，觀察并記錄動物在3 min內雙后肢跨越方格的個數(水平運動)與前肢騰空或攀爬墻壁的次數(垂直運動)。實驗在無明顯光源的環(huán)境中進行，觀察完畢擦拭箱內壁及底面，以免上次動物余留的信息影響下次測試結果。

(3)新奇攝食實驗：小鼠禁食不禁水24 h后，將動物面向箱壁從同一位置放入實驗箱中，實驗箱規(guī)格為50 cm × 50 cm × 40 cm，箱中心放入適量等體積食物，適應30 s后，觀察并記錄小鼠5 min內首次咀嚼食物的時間。實驗在無明顯光源的環(huán)境中進行，觀察完畢擦拭箱內壁及底面，以免上次動物余留的信息影響下次測試結果。

1.3.6 腫瘤標志物、單胺類神經遞質含量的檢測

小鼠禁食禁水24 h后取血，4℃靜置2 h后，3000 r/min，10 min離心，取上清液，置于液氮中速凍，后轉移至超低溫保存箱備用。將保存?zhèn)溆玫难寤蜓獫{樣本在室溫下解凍，嚴格按CA153、CA125、CEA、5-HT、DA、NE的ELISA試劑盒操作檢測血中各指標的含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 乳腺腫瘤瘤重和瘤體積的變化

腫瘤離體后可見，乳腺腫瘤呈不規(guī)則的長橢圓形、球形或結節(jié)形，外表有完整的包膜包被，顏色為肉紅色，有豐富的血管包裹，部分腫瘤分化生長成多個瘤體，或者有黑色的壞死區(qū)，質硬。肉眼觀看可見，乳腺癌皮質酮組小鼠的腫瘤大于或基本等于乳腺癌組小鼠的腫瘤。結果見圖1。通過數據統計分析可知，與乳腺癌組比較，乳腺癌皮質酮組瘤重、瘤體積均升高，差異有顯著性(P< 0.05)。結果見表1。

2.2 腫瘤標志物含量變化

與正常對照組比較，抑郁癥組腫瘤標志物CA153，乳腺癌組CA153和CA125，乳腺癌皮質酮組小鼠腫瘤標志物CA153、CA125和CEA均明顯上升(P< 0.01或P< 0.05)。與抑郁癥組比較，乳腺癌皮質酮組CA153、CA125和CEA明顯升高(P< 0.01)。與乳腺癌組比較，乳腺癌皮質酮組CA153、CA125和CEA表達差異無顯著性。結果見表2。

2.3 行為學變化

2.3.1 小鼠快感缺乏的變化

與正常對照組比較，造模第二周抑郁癥組和乳腺癌皮質酮組糖水消耗明顯降低，差異有顯著性(P< 0.05)；第三周時，抑郁癥組、乳腺癌組和乳腺癌皮質酮組糖水消耗明顯下降(P< 0.01或P< 0.05)。與乳腺癌組比較，乳腺癌皮質酮組造模第三周的糖水消耗顯著減少(P< 0.05)。結果提示，乳腺癌小鼠在接受了21 d皮質酮注射后，明顯存在快感缺乏癥狀。結果見表3。

注：A：乳腺癌組；B：乳腺癌皮質酮組。圖1 各組小鼠乳腺腫瘤肉眼形態(tài)特征Note. A: Breast cancer group; B: Breast cancer with corticosterone group.Figure 1 Morphological characteristics of mammary gland tumors in each group of mice

組別Groups瘤重(g)Tumor weight瘤體積(mm3)Tumor volume正常對照組Control group00乳腺癌組Breast cancer group0.919±0.4396.93±479.64乳腺癌皮質酮組Breast cancer with corticosterone group 1.12±0.38#1204.16±619.60#

注：與乳腺癌組比較，#P< 0.05。

Note. Compared with the breast cancer group,#P< 0.05.

表2 各組小鼠血漿乳腺癌相關標志物的含量±s，n=10)

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與抑郁癥組比較，##P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the depression group,##P< 0.01.

表3 乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠糖水消耗的變化±s，n=10，%)

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與乳腺癌組比較，▲P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the breast cancer group,▲P< 0.05.

2.3.2 小鼠自主行為、探究和環(huán)境恐懼意識的變化

與正常對照組比較，抑郁組、乳腺癌皮質酮組小鼠經過格子數、直立次數明顯下降(P< 0.05)，乳腺癌組僅經過格子數明顯下降，差異有顯著性(P< 0.05)；抑郁組、乳腺癌組、乳腺癌皮質酮組小鼠首次攝食所耗時間明顯上升，差異有顯著性(P< 0.05)。與抑郁癥組比較，乳腺癌皮質酮組小鼠曠場實驗經過格子數和直立次數均下降，差異有顯著性(P< 0.01或P< 0.05)。與乳腺癌組比較，給予皮質酮組后癌癥小鼠經過格子數、直立次數明顯降低，首次攝食所耗時間明顯上升，差異有顯著性(P< 0.01或P< 0.05)。提示，乳腺癌小鼠在接受皮質酮造模后，缺乏在新奇環(huán)境中的自主行為、探索與攝食欲望，存在饑餓與對新環(huán)境恐懼的矛盾沖突。結果見表4。

2.4 單胺類神經遞質含量的變化

與正常對照組比較，抑郁組和乳腺癌皮質酮組小鼠血液中單胺類神經遞質NE、DA和5-HT均明顯下降，差異有顯著性(P< 0.01)，乳腺癌組單胺類神經遞質無明顯變化；與抑郁癥組比較，乳腺癌皮質酮組NE、DA和5-HT明顯降低(P< 0.01或P< 0.05)；與乳腺癌組比較，乳腺癌皮質酮組僅NE、DA明顯降低(P< 0.01)。結果見表5。

3 討論

2015年中國30～59歲女性的乳腺癌患病率位居癌癥首位[6]。抑郁是乳腺癌病人普遍存在的一種心理狀態(tài)，手術方式、家庭支持、收入水平、婚姻狀況和受教育程度等因素均會影響乳腺癌患者抑郁的發(fā)生[7]。但是，目前乳腺癌并發(fā)抑郁癥的針對性治療明顯不足，其并發(fā)機制也尚未見闡明。因此，建立一種乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠模型將有利于疾病防治的開展。

首先，本實驗選用了經典的BABL/c小鼠4T1炎性乳腺癌細胞接種的方式建立了乳腺癌模型，該模型被認為與人類乳腺癌具有相似的生物學特性，是研究乳腺癌的理想模型[8]。其次，經典的抑郁癥造模方法有應激造模、手術造模以及遺傳性造模等，由于本實驗已經選定了BABL/c小鼠，并進行了乳腺癌細胞接種，為了避免造模過程中物理性損傷乳腺癌瘤體，并減少動物的死亡率，故實驗選用慢性注射皮質酮進行抑郁造模[9]。

表4 乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠曠場實驗、新奇攝食實驗的變化±s，n=10)

注：與正常對照組比較，*P< 0.05；與抑郁癥組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與乳腺癌組比較，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the depression group,#P< 0.05,##P< 0.01. Compared with the breast cancer group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

表5 各組小鼠血清中單胺類神經遞質的含量±s，n=10)

注：與正常對照組比較，**P< 0.01；與抑郁癥組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與乳腺癌組比較，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01. Compared with the depression group,#P< 0.05,##P< 0.01. Compared with the breast cancer group,▲▲P< 0.01.

CA153是臨床上應用于乳腺癌的特異血清腫瘤標志物，在乳腺癌的診斷、療效檢測及預后判斷等方面應用比較廣泛。CA153作為一種糖抗原，可在乳腺癌發(fā)生時，從癌細胞膜上分離出來，并釋放到血液中。而CA125作為一種跨膜糖蛋白，在機體正常的情況下，是無法進入到血清中的，只有當浸潤性腫瘤細胞破壞組織結構時，其才會釋放入血。皮亞平等[10]認為，CA125和CA153的聯合檢查在乳腺癌的確診過程中具有重要的角色，可大大提高疾病診斷的準確率。此外，CEA是一種具有人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，其在晚期乳腺癌和發(fā)生轉移的患者中陽性率較高。劉珍等[11]通過臨床研究發(fā)現，IV期乳腺癌患者血清中CEA和CA153水平明顯高于III期，且以上兩者表達陰性組化療有效率和存活率均明顯高于陽性組。由此可見，CA125、CA153、CEA在乳腺癌的診斷、治療效果、預后評估等方面均可作為重要參考依據。因此，本實驗采用以上三者作為乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠模型的評價指標，結果可見，給予乳腺癌小鼠皮質酮后，小鼠血漿中CA125、CA153、CEA均顯著增加。此外，通過對乳腺腫瘤的瘤重和瘤體積分析可知，乳腺癌皮質酮組小鼠的瘤重和瘤體積比乳腺癌小鼠顯著增加，故推測抑郁可能會加重乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

目前，針對嚙齒類動物的行為學研究已經發(fā)展的比較成熟，常見的行為學檢測方法也是圍繞獎賞、探索、絕望等多個角度展開。其中，獎賞方面主要包括糖水偏好行為檢測、顱內自我刺激實驗等，而探索方面主要包括新奇攝食實驗、曠場實驗、高架十字迷宮實驗等，絕望方面則是強迫游泳實驗和懸尾實驗等[12]。由于模型小鼠腋下靠近背部有一個明顯的瘤體，且每個小鼠瘤的大小并不一致，對小鼠的游泳和懸尾等行為有明顯干擾，會導致相應的實驗結果誤差較大。故本實驗主要針對模型小鼠獎賞和探索兩個方面進行了研究，選擇了糖水消耗實驗、曠場實驗和新奇攝食實驗。與此同時，本實驗還選取了抑郁癥發(fā)生的典型指標，單胺類神經遞質5-HT、NE、DA，與行為學指標一些，協同評價各組大鼠的抑郁癥狀態(tài)。結果發(fā)現，乳腺癌小鼠在造模第3周開始表現出快感缺失，其對于環(huán)境的探索欲望下降，但體內單胺神經遞質含量沒有顯著下降，即抑郁程度弱于抑郁癥組小鼠。而乳腺癌小鼠在接受了慢性皮質酮注射后，其獎賞行為和探索行為均表現出明顯變化，體內單胺神經遞質顯著減少，抑郁程度較抑郁組小鼠更為嚴重。故實驗推測，乳腺癌小鼠在沒有接受抑郁造模時，雖然表現出了部分抑郁樣行為，但此時個體差異較大，很難開展乳腺癌并發(fā)抑郁癥的研究工作。只有對其施加一定的應激措施，誘使其發(fā)展為乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠后，其有關抑郁的行為學表現和神經遞質水平才會比較穩(wěn)定，更適合進行下一步的研究工作。

4T1炎性乳腺癌細胞接種聯合皮質酮注射誘導的乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠不僅具備了典型的抑郁樣癥狀和明顯的神經遞質變化，而且在乳腺癌標志物方面表現出明顯異常，可作為一種乳腺癌并發(fā)抑郁癥動物模型，被用于該疾病的發(fā)病機制研究或是藥物防治研究，具有較好的參考價值。