常 凱，高繼萍，宋曉娜，續(xù)國強，衛(wèi)佳寧，田曉琳，宋國華*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001； 2.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中 030600)

口腔癌是常見的惡性腫瘤，在全球常見癌癥中居第6位，其中90%屬口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，口腔癌發(fā)病率高且預(yù)后生存率低。microRNA(miRNA)的異常表達與口腔癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[1]。miR-34是一類在進化上非常保守的miRNA，miR-34家族(miR-34s)包括三個同源基因：miR-34a、miR-34b及miR-34c。研究發(fā)現(xiàn)：miR-34c參與肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌等常見癌癥的發(fā)生，主要通過促進腫瘤細胞凋亡；抑制腫瘤細胞增殖與分化；抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移等生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮抑制腫瘤的作用。但是并沒有關(guān)于miR-34c在口腔癌的功能的報道，我們課題組進行miRNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34c在口腔黏膜癌組織特異性表達，提示我們miR-34c對于口腔黏膜癌的臨床價值，為進一步明確miR-34c在口腔癌中的作用，我們利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)miR-34c在口腔癌中的表達，探討miR-34c對口腔癌細胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

實驗選用清潔級雄性8～10周齡的中國地鼠60只，體重25～35 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK (晉) 2015-0001]。屏障環(huán)境[SYXK (晉) 2015-0001]中飼養(yǎng)，溫度為25℃左右，相對濕度40%～70%。動物實驗嚴格按照山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理委員會制定的操作規(guī)程(IACUC號：2015011)，符合3R原則。

1.1.2 細胞株

體外實驗選用人舌鱗癌細胞株Tca8113購自Boster(博士德)。

1.2 主要試劑與儀器

TriPure Isolation Reagent試劑購于Roche;All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit,All-in-OneTMqPCR Mix和All-in-OneTMqPCR Primer均購于GeneCopoeia;脂質(zhì)體RNAiMAX試劑購于Invitrogen;Opti-MEM培養(yǎng)基購于Gibco;miRNA-34c mimics和miRNA-34c inhibitor均由Gene Pharma合成；Express miRNA Extraction試劑盒，HG Taq Man miRNA cDNA Synthesis試劑盒和HG Taq Man miRNA qPCR試劑盒均購自Hai Gene;RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone;胰酶、胎牛血清和Cell-Counting Kit-8試劑盒購自Boster;100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素購自Solarbio。普通PCR儀(美國Bio-Rad公司);Step one plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司);酶標儀(美國Bio-Rad公司);CO2細胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織miR-34c表達水平的檢測

0.5% DMBA丙酮液涂擦中國地鼠雙側(cè)頰囊制備口腔黏膜癌模型。本實驗選取中國地鼠口腔癌組織和正常組織(保存于-80℃冰箱)進行qPCR驗證實驗。用TriPure提取中國地鼠口腔癌和正常組織總RNA(各取3只中國地鼠)，用分光光度計測定RNA濃度和純度，A260/A280均在2.0左右。然后按照miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以大鼠5s RNA作參照進行相對定量分析，根據(jù)All-in-OneTMqPCR Mix說明書進行。qRT-PCR采用3步法：Stage 1(預(yù)變性)：95℃，10 min，1個循環(huán)；Stage 2(PCR反應(yīng))95℃，10 s，60℃，20 s，然后72℃，10 s，40個循環(huán)；Stage 3(溶解曲線分析)72℃～95℃，溫度間隔0.5℃，10 s/each。結(jié)果以2-ΔΔCt法表示miRNA-34c的相對表達量。

1.3.2 細胞的培養(yǎng)

Tca8113于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細胞的轉(zhuǎn)染

將細胞接種于培養(yǎng)板，待細胞融和度達到60%～80%按照Lipofectamine RNAiMAX Reagent說明書進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，實驗分為miR-34c模擬物組(miR-34c mimics，終濃度為50 nmol/L)、miR-34c抑制物組(miR-34c inhibitor，終濃度為50 nmol/L)和空白對照組(control)。hsa-miR-34c mimics序列為：AAUCACUAACCACACGGCCAGG，UGGCCGUGUGG UUAGUGAUUU；hsa-miR-34c inhibitor序列為：CCUG GCCGUGGUUAGUGAUU。

1.3.4 細胞中miR-34c表達水平的檢測

按照Express miRNA Extraction試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)染48 h處于生長對數(shù)期細胞的miRNA，使用酶標儀測定提取的濃度及純度(A260/A280)。按照HG Taq Man miRNA cDNA Synthesis試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用加A法進行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR按照HG Taq Man miRNA qPCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系(20 μL體系)。以RNU6B作為內(nèi)參，采用2步法：Stage 1(Holding stage)95℃，10 s，1個循環(huán)；Stage 2(Cycling stage)95℃，10 s，然后60℃，60 s，40個循環(huán)。結(jié)果以2-ΔΔCt法表示miRNA-34c的相對表達量。

1.3.5 細胞增殖能力的檢測

按每孔1.0 × 103的密度將細胞接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，待細胞貼壁融和度達到60%～80%后，加入轉(zhuǎn)染試劑，按照CCK-8試劑說明書，于加入轉(zhuǎn)染試劑之前和加入轉(zhuǎn)染試劑24 h、48 h、72 h后在酶標儀450 nm波長處檢測每孔吸光度(optical density，OD)值，以O(shè)D值反映細胞增殖情況。

1.3.6 細胞遷移能力的檢測

將生長狀態(tài)良好的細胞接種于六孔板，待細胞貼壁后加入轉(zhuǎn)染試劑，待細胞生長密度達到90%以上，用200 μL無菌槍頭在6孔板內(nèi)以“1”字形劃痕，然后立即用PBS漂洗懸浮細胞，加入RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后0 h、24 h、48 h和72 h在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞愈合情況，用Image Pro Plus 6.0處理圖片并記錄相對遷移距離。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 miR-34c在口腔癌細胞中的表達Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 2 Expression of miR-34c in the Tca8113 cells

2 結(jié)果

2.1 口腔癌中miR-34c的表達

課題組在前期已成功構(gòu)建中國地鼠口腔頰囊黏膜癌和鱗癌模型，并對口腔黏膜癌組織和正常組織進行高通量測序技術(shù)測序及生物信息分析，發(fā)現(xiàn)miR-34c在中國地鼠口腔黏膜癌組織中表達顯著上調(diào)，對其進行qPCR驗證，結(jié)果表明：與正常組織相比，口腔癌組織中miR-34c表達明顯升高，其表達量是正常組的11.95倍。結(jié)果見圖1所示。

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖1 口腔癌組織中miR-34c表達量Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 1 Expression of miR-34c in the oral squamous cell carcinoma tissues

2.2 miR-34c轉(zhuǎn)染效率的檢測

轉(zhuǎn)染miR-34c inhibitor后，miR-34c表達量是對照組的0.166倍，miR-34c表達量明顯下調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。轉(zhuǎn)染miR-34c mimics后，miR-34c表達量是對照組的280.917倍，miR-34c表達量明顯上調(diào)，差異有顯著性(P< 0.01)。結(jié)果見圖2。

2.3 miR-34c對Tca8113細胞增殖能力的影響

72 h的CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-34c mimics組的增殖能力顯著減弱(P<0.01)，miR-34c inhibitor組的增殖能力顯著增強(P<0.05)，說明上調(diào)miR-34c表達可抑制細胞增殖，降低細胞活力。結(jié)果見圖3。

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 調(diào)節(jié)miR-34c表達水平對Tca8113細胞活力的影響Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 3 Effect of miR-34c on the proliferation of tongue cancer cell line Tca8113 cells

2.4 miR-34c對Tca8113細胞遷移能力的影響

劃痕實驗顯示，隨著時間的推移，各組遷移距離都逐漸增加。與對照組72 h遷移擴張距離相比，miR-34c mimics組的遷移能力與對照組差異無顯著性，miR-34c inhibitor組的遷移能力顯著增強，說明下調(diào)miR-34c表達可促進細胞遷移。結(jié)果如表1和圖4所示。

表1 調(diào)節(jié)miR-34c表達水平對Tca8113細胞遷移的影響

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

多種miRNA在口腔癌中異常表達，其與口腔鱗狀細胞癌(OSCC)的發(fā)生、診斷及預(yù)后密切相關(guān)[2]。miRNA可作為癌基因或抑癌基因，對腫瘤的生物學(xué)行為有重要的調(diào)控作用[3 - 5]。miR-34a/375/195/26a/29b等miRNA可通過多種轉(zhuǎn)錄因子和靶基因來調(diào)控舌鱗癌細胞的增殖、周期、遷移、侵襲和凋亡，并與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及預(yù)后等臨床病理特點相關(guān)，為舌鱗癌患者的預(yù)后判斷以及手術(shù)和靶向治療方案提供了參考[6]。

本課題組前期利用高通量測序成功構(gòu)建中國地鼠口腔癌組織和正常組織差異表達的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)11個表達差異有顯著性的miRNA。我們挑選了與腫瘤密切相關(guān)的miR-34c，對其進行qPCR驗證，結(jié)果表明miR-34c在口腔癌組織中表達顯著上調(diào)[7]。人類miR-34家族包括miR-34a、miR-34b和miR-34c。在正常細胞中miR-34a發(fā)揮促進細胞衰老、使細胞周期阻滯在G1期和誘導(dǎo)細胞凋亡等作用[8]。miR-34a也參與乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤、胰腺癌和肺癌等多種疾病的發(fā)生[9 - 10]，Jia等[11]的研究表明miR-34a靶向調(diào)控MMP-9和MMP-14，從而抑制舌鱗狀癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。miR-34a在TSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后和基因治療中也具有潛在的應(yīng)用價值。miR-34b和miR-34c也具有潛在的抑癌作用[12]。miR-34c在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、喉癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤中表達下調(diào)[13]。武震東[14]轉(zhuǎn)染miR-34c-3p mimics和miR-34c-5p mimics于膠質(zhì)瘤細胞，結(jié)果表明miR-34c可抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲，使細胞周期停滯在S期及G2/M期的，誘導(dǎo)細胞凋亡。miR-34家族與p53形成抗腫瘤正反饋環(huán)路：p53由于DNA損傷被激活，活化的p53促使miR-34s表達，從而抑制c-myc、E2F3、Cyclin E2、CDK6、MET、BCL-2等相關(guān)蛋白，導(dǎo)致細胞凋亡。同樣miR-34s也可通過抑制組蛋白去乙酰酶SIRT1，從而促進p53因乙?；罨痆15]。

注：A：對照組；B：miR-34c模擬物組；C：miR-34c抑制物組。圖4 調(diào)節(jié)miR-34c表達水平對Tca8113細胞遷移的影響(× 40)Note. A: Control group; B: miR-34c mimics group; C: miR-34c inhibitor group.Figure 4 Effect of miR-34c on the migration of tongue cancer cell line Tca8113 cells

為了進一步研究miR-34c在口腔癌中的作用機制，本研究通過體外轉(zhuǎn)染miR-34c mimics和miR-34c inhibitor，探討miR-34c對口腔癌Tca8113細胞中的生物學(xué)行為的影響。于轉(zhuǎn)染48 h后利用qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率，miR-34c模擬物組和抑制物組miR-34c的表達量較對照組都差異有顯著性，提示轉(zhuǎn)染成功。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率高，但也存在會對細胞產(chǎn)生毒性的問題，于轉(zhuǎn)染24 h后CCK-8和劃痕實驗結(jié)果表明，細胞活力和遷移距離都有降低的趨勢，轉(zhuǎn)染條件還需進一步優(yōu)化。我們的實驗結(jié)果表明，細胞轉(zhuǎn)染72 h后miR-34c對細胞具有抑制增殖和遷移的作用，在高寧[16]、王萌[17]、李甫鑰[18]和張金霞[19]的實驗中都得到了類似的結(jié)論，高表達miR-34c可抑制細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡。轉(zhuǎn)染miR-34c在不同細胞中發(fā)揮作用的時間不同，武震東[14]的實驗結(jié)果表明：上調(diào)miR-34c 48 h后，可抑制膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲能力，這可能是由于腫瘤異質(zhì)性造成的。miR-34c在多種腫瘤中表達下調(diào)，提示miR-34c有潛在的抑癌作用，這與我們的實驗結(jié)果一致，但我們的高通量測序結(jié)果表明miR-34c在癌組較正常組高表達，這需要我們進一步明確其機制來作出判斷。腫瘤的發(fā)生是多基因協(xié)同作用的結(jié)果[20]，miRNA存在個體差異[15]，口腔癌的組織學(xué)表型和染色體分析的結(jié)果表明口腔癌中存在不同表型的腫瘤細胞[21-22]。miR-34c作為口腔癌的標志物投入臨床使用仍需進一步的探究和驗證。

介于miRNA的特性，通過調(diào)控其表達抑制腫瘤是目前腫瘤治療的新策略。以miRNA為基礎(chǔ)的基因治療進入了一個新的階段，有很大的應(yīng)用前景[23]。在miR-34的表達受到抑制或下調(diào)的情況下，可通過合成miR-34類似物，增加miR-34的表達；或在miR-34異常表達導(dǎo)致病變時，可利用反義寡核苷酸直接結(jié)合miR-34阻斷其活性，從而發(fā)揮治療作用[24]。

注：中國地鼠(Cricetulusbarabensisgriseus)是倉鼠科倉鼠亞科動物，在公開出版物中使用倉鼠作為名稱更為科學(xué)。但鑒于目前我國實驗動物國家標準中提到的動物的種類都是地鼠，作為專業(yè)人員能夠清楚該物種在動物分類中地位，并不妨礙科學(xué)研究的成果和使用。中文名稱后面的拉丁文不會對該研究的主體產(chǎn)生歧義，故本文在發(fā)表時仍沿用“中國地鼠”，待國標修訂后再統(tǒng)一命名為“倉鼠”。