重慶市鳳鳴山中學(400037)

馮漢茹

1 教學背景

組成細胞的有機物主要包括糖類、蛋白質、核酸和脂質等，某些化學試劑能和這些有機物產(chǎn)生相應的顏色反應，借助人的感官對顏色反應的直接觀察或對比觀察，以此檢測和驗證生物組織中某種物質的存在。但開展物質鑒定類實驗有2個弱點：①學生不能一一對應鑒定試劑和被檢測物質的關系，無法客觀地評價實驗結果；②學生因不清楚試劑配置過程以致混淆操作步驟，無法準確地描述分析實驗的現(xiàn)象?；诖?，本文選取斐林試劑、班氏試劑、雙縮脲試劑、二苯胺試劑、吡羅紅甲基綠混合染色劑和龍膽紫溶液展開介紹，對比學習試劑配置過程和使用方法，有利于物質鑒定類實驗的順利開展和推進。

2 斐林試劑與班氏試劑

糖的化學本質是多羥基醛或多羥基酮以及它們的衍生物或多聚物。鑒定可溶性還原糖(如葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖和堿性溶液中的果糖等)常用斐林試劑或班氏試劑。

斐林試劑由質量濃度0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液(甲液)和質量濃度0.05 g/mL的硫酸銅溶液(乙液)配制而成，二者混合后立即生成了新鮮的淡藍色氫氧化銅沉淀。其中，0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液是由10 g氫氧化鈉，加蒸餾水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中配置而成。0.05 g/mL的硫酸銅溶液是由5 g硫酸銅，加蒸餾水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中配置而成。反應原理為：Cu2+具有弱氧化性，還原糖的醛基(-CHO)具有還原性可在水浴加熱條件下被氧化為酸，Cu(OH)2被還原為磚紅色Cu2O沉淀，顏色變化為淡藍色——棕色——磚紅色。反應式為：R-CHO+2Cu(OH)2→R-COOH+Cu2O↓+2H2O。醛被氧化形成了酸，而酮不能被斐林試劑氧化，所以斐林試劑除了鑒定還原糖之外，還可以區(qū)別醛和酮。

配制斐林試劑需要將甲液、乙液等量混合均勻后形成Cu(OH)2懸濁液。若先加入甲液，組織中的有機酸與NaOH迅速反應，反應物中Cu(OH)2沒有或不足，繼而還原糖的半縮醛羥基易被氧化而失去還原性，再加入硫酸銅溶液不能產(chǎn)生Cu2O沉淀，只有將二者先混合配置后，才能產(chǎn)生Cu(OH)2，所以斐林試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。若斐林試劑久置過后，在使用前搖勻也不能用，因為現(xiàn)用現(xiàn)配的“有效成分”是新制的處于懸浮透明膠體狀態(tài)Cu(OH)2，放置過久，Cu(OH)2會完全沉淀，反應很慢甚至沒有反應。

班氏試劑也稱本尼迪特試劑，Cu2+在OH-存在的條件下氧化還原糖中的醛基，自身則被還原成磚紅色Cu2O沉淀。其有兩種配制方法：①由硫酸銅、無水碳酸鈉和檸檬酸鈉配成的弱堿性藍色溶液，存放備用；②由硫酸銅、碳酸鈉和枸櫞酸鈉配成的弱堿性藍色溶液，主要成分是Cu2+和枸櫞酸根離子形成的物質，存放備用。

3 雙縮脲試劑

蛋白質是由氨基酸組成的一類生物大分子，是生命的物質基礎。鑒定蛋白質或多肽常用雙縮脲試劑。雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)與雙縮脲試劑并不相同。將尿素加熱到熔點以上，2分子尿素之間失去1分子氨生成了雙縮脲，即NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2→NH2-CO-NH-CO-NH2+NH3↑。雙縮脲含有化學里的酰胺鍵，生物中也稱肽鍵(-CO-NH-)，能與堿性溶液中的Cu2+結合生成紫色絡合物，從而發(fā)生雙縮脲反應。

蛋白質或多肽的肽鍵和雙縮脲的肽鍵相同，凡含有兩個及兩個以上肽鍵的蛋白質或多肽能與雙縮脲試劑發(fā)生紫色反應，檢測生物組織中是否含有蛋白質。即便蛋白質在加熱條件下變性，空間結構發(fā)生改變，但肽鍵并沒有破壞，只要含有兩個及兩個以上肽鍵，雙縮脲試劑依然能和變性的蛋白質發(fā)生紫色反應。但雙縮脲試劑不能與二肽或尿素發(fā)生紫色反應，而是出現(xiàn)藍色絡合物沉淀。

雙縮脲試劑由質量濃度0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液(雙縮脲試劑A)和質量濃度0.01 g/mL的硫酸銅溶液(雙縮脲試劑B)配制而成。

鑒定蛋白質操作過程有兩種：①先向試管內加入一定量的待測組織樣液，再加入適量的雙縮脲試劑A液，混合均勻后再滴入幾滴雙縮脲試劑B液以制得堿性條件下中的Cu2+，觀察試管中顏色變化；②先向試管內加入適量的雙縮脲試劑A液，再滴入幾滴雙縮脲試劑B液，混合均勻后，再加入一定量待測組織樣液，觀察試管中顏色變化。待測組織樣液和雙縮脲試劑加入的順序可以改變，但雙縮脲試劑A液、雙縮脲試劑B液是先后加入的，不可顛倒以造成堿性環(huán)境。若先加入雙縮脲試劑B液，后加入雙縮脲試劑A液，重金屬鹽CuSO4讓蛋白質變性溶解度變小的同時，CuSO4與NaOH發(fā)生復分解反應無法制造堿性環(huán)境還生成了藍色氫氧化銅Cu(OH)2沉淀，導致現(xiàn)象模糊，無法達到實驗目的。

4 吡羅紅甲基綠混合染色劑與二苯胺試劑

吡羅紅甲基綠混合染色劑呈堿性，含有“兩”種染料，常用來觀察DNA、RNA在胞內的分布，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

混合使用的原因如下。

(1)甲基綠呈藍綠色，吡羅紅(也稱派洛寧或焦寧)呈紅色，在沒有結合核酸的情況下也是“本色”。

(2)若分別用甲基綠、吡羅紅染料染兩組細胞，甲基綠既結合DNA又結合RNA，均為藍綠色，無法區(qū)別DNA、RNA的分布；吡羅紅既結合DNA又結合RNA，均為紅色，也無法區(qū)別DNA、RNA的分布。

簡言之，僅用甲基綠，無法鑒定DNA亦無法鑒定RNA。兩種染料混合使用，它們對DNA、RNA親和力不同，甲基綠更親合聚合程度高的DNA呈現(xiàn)綠色，吡羅紅更親合聚合程度低的RNA呈現(xiàn)紅色，從而可以區(qū)別二者的主要分布。

鑒定DNA常用二苯胺[(C6H5)2-NH]試劑，而不使用甲基綠。二苯胺試劑與DNA混勻，在沸水浴條件下呈藍色。它有兩種配制方法。

(1)取0.8 g二苯胺溶于180 mL冰醋酸中，再加入8 mL 60%以上的過氯酸，混勻待用，臨用前加入0.8 mL 1.6%的乙醛溶液，配置成無色溶液。

(2)取1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸，再加入1.5 mL濃硫酸，棕色瓶保存，制得A液；隨后配置體積分數(shù)0.2%的乙醛溶液為B液，再取0.1 mL B液加入A液，制成二苯胺試劑。

DNA在沸水浴條件下與二苯胺試劑反應顯示藍色。反應原理為：DNA中嘌呤核苷酸的脫氧核糖與酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛，ω-羥基-γ酮基戊醛與(C6H5)2-NH反應顯示藍色，即DNA+CH3COOH+C6H5-NH-C6H5→藍色物質。所以，鑒定DNA用二苯胺試劑，而區(qū)分DNA、RNA的分布用吡羅紅甲基綠混合染色劑。

5 龍膽紫溶液、醋酸洋紅染液、改良苯酚品紅溶液

染色體由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成，易被堿性染料染成深色的物質，具體來說，用龍膽紫溶液、醋酸洋紅染液、改良苯酚品紅溶液來鑒定染色體，它們分別將染色體染成紫色、紫紅色、紫紅色。龍膽紫，堿性染料，主要是結晶紫和甲基紫的混合物。配制方法：取30 mL冰醋酸加熱至40 ℃，放入0.75 g龍膽紫，溶解后加入70 mL蒸餾水，過濾后備用。醋酸洋紅染液配制方法：取100 mL45%的醋酸溶液，加入0.5～1 g洋紅，煮沸5 min或加回流煮沸12 h，冷卻后進行過濾，再加入1%～2%鐵明礬水溶液數(shù)滴，直到該液體變?yōu)榘导t色不發(fā)生沉淀為止，最后將液體放入棕色瓶中貯存避免陽光直射。改良苯酚品紅(也稱改良堿性品紅)溶液由堿性品紅混合液與苯酚混合而成，配制方法：母液A，取3 g堿性品紅溶解在100 mL70%的酒精；母液B，取10 mL母液A，加入90 mL5%的苯酚水溶液；苯酚品紅溶液，取45 mL母液B，加入6 mL冰醋酸和6 mL 37%的甲醛；改良苯酚品紅溶液，取2～10 mL苯酚品紅溶液再加入98～90 mL45%的冰醋酸和1.8 g山梨醇。

6 總結

綜上所述，用顏色反應鑒別生物組織中的物質時應仔細了解試劑配置過程和使用方法，靈活分辨被檢測物質和鑒定試劑的化學反應原理，在本學科知識正確指導的前提下，再培養(yǎng)學生進行實驗的操作能力、觀察能力、分析能力。