郭 琳，李玉澤，毛昭琦，熱薩來提，宋小妹，崔九成，范少敏△

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽 712000)，2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(西安710069)，3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)

主題詞 中藥學(xué) 竹根七 質(zhì)量控制

竹根七為百合科開口箭屬植物開口箭(Tupistra chinensis baker.)的根莖。生于海拔1000～2000m的林下陰濕處、溪邊或路旁。分布于陜西、湖北、江西、福建、浙江等地，陜西以秦嶺以南的平利、洛南、鎮(zhèn)坪、眉縣分布較多，全年可采。多作為民族或民間用藥，性寒，味微苦、辛，具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕，散瘀止痛等功效，用來治療頭痛咳嗽、咽喉腫痛，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛和跌打損傷等病癥[1-5]?，F(xiàn)代研究表明甾體皂苷類為竹根七的主要化學(xué)成分[6]，竹根七提取物具有抗炎、抗腫瘤和抑菌等[7-12]藥理作用，2015版《陜西省藥材標(biāo)準(zhǔn)》收錄的竹根七標(biāo)準(zhǔn)未采用高效液相法進(jìn)行含量測定，在薄層鑒別中選取的對照品具有一定局限性，本文在對竹根七進(jìn)行系統(tǒng)化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，從竹根七的植物形態(tài)、藥材性狀、顯微特征、TLC 法鑒別、HPLC 法測定含量和指紋圖譜等方面，建立竹根七藥材的質(zhì)量評價體系，為藥材的質(zhì)量規(guī)范和臨床療效保證提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1.1 藥材:竹根七分別購于陜西漢中，陜西眉縣紅河谷，寶雞鳳縣等地，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為百合科開口箭屬植物開口箭Tupistra chiensis Baker.的干燥根及根莖。

1.2 儀器及試劑:高效液相色譜儀(Waters Alliance e2695，2998PDA檢測器)(美國waters公司)；GB204電子天平(精密度0.1 mg)；HHS2I-8電熱恒溫水浴鍋；舒美KQ-500DE型超聲波清洗儀；K101-0ES型電熱鼓風(fēng)干燥箱；200-JRAB型高速萬能粉碎機；顯微鏡DMBH200，微型計算機(型號：啟天M430E；批號：P580A2717042)。乙腈為色譜純; 其余均為分析純; 水為娃哈哈純凈水; 對照品 Tupistroside E 為實驗室自制, 經(jīng) HPLC 檢驗，純度>98%，符合含量測定要求。

2 方 法

2.1 植物形態(tài):其原植物開口箭為多年生草本。根狀莖長，圓柱形，直徑1～1.5 cm，多節(jié)，綠色至黃色。葉基生，4～12枚，近革質(zhì)或紙質(zhì)，倒披針形、條狀披針形，長15～65 cm，寬1.5～9.5 cm，先端漸尖，基部漸狹，鞘葉2枚披針形或距圓形，長2.5～10 cm。穗狀花序直立，少有彎曲，密生多花，2.5～9 cm；總花梗短，長1～6 cm；花短鐘狀，長5～7cm，花被筒長2-2.5 cm；裂片卵形，先端漸尖，長3～5 cm，寬約2～4 cm，肉質(zhì)，黃色或黃綠色；花絲基部擴大，其擴大部分有的貼生于花被片上，有的彼此連合，花絲上部分離，長1～2 cm，內(nèi)彎，花藥卵形；子房近球形，直徑2.5 mm，花柱不明顯，柱頭墩三棱形，頂端三裂。漿果球形，熟時紫紅色，直徑8～10 mm?；ㄆ?～8月，果期8～10月[3]。

2.2 性狀:根莖扁圓柱形，略彎曲，長10-15 cm, 直徑1-1.8 cm，節(jié)明顯，略膨大，節(jié)處有芽及膜質(zhì)鱗片狀葉，節(jié)間短。表面黃棕色或黃綠色，有縱皺紋，節(jié)處有明顯的環(huán)狀皺紋，并散有圓點狀的須根痕。質(zhì)略硬，易折斷，斷面淺黃白色，細(xì)顆粒狀。無臭，味微甘而苦澀。

2.3 顯微特征:粉末：黃白色。淀粉粒稀少 ，單粒類圓形，臍點、層紋不明顯，草酸鈣針晶成束或散在。螺紋、梯紋導(dǎo)管多見，偶見網(wǎng)紋導(dǎo)管。殘留基生葉表皮細(xì)胞長條形或長多角形，垂周壁連珠狀增厚。

3 結(jié) 果

3.1 薄層色譜鑒別:精密稱取竹根七粉末1.0 g，置于100 ml具塞錐形瓶中，然后加20 ml的60%甲醇水，加熱回流提取1.5 h，濾液蒸干，殘渣加水20 ml溶解,用水飽和正丁醇萃取3次后合并萃取液蒸干, 浸膏加入2 ml甲醇溶解,作為供試品溶液。另取鄰苯二甲酸二丁酯和Tupistroside E 對照品，用甲醇溶解后，制成每1 ml含2.0 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)實驗,吸取上述溶液各3 μL，分別點于硅膠GF254 薄層板上，展開劑采用三氯甲烷∶甲醇∶水(7∶3∶1)下層液，取出晾干后噴10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯示相同顏色的斑點，見圖1。

注：A為254 nm波長下觀察，B為日光下觀察；1對照品鄰苯二甲酸二丁酯，2紅河谷，3漢中，4鳳縣，5 Tupistroside E供試品

圖1 竹根七供試品及對照品薄層色譜

3.2 含量測定

3.2.1 色譜條件：依利特 Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm )色譜柱; 柱溫30℃; 流速1 ml/min。流動相為乙腈( A)-水(B )梯度流動相, 檢測波長203 nm;見表1。在該色譜條件下，Tupistroside E對照品保留時間約為21.87 min，3種產(chǎn)地供試品色譜Tupistroside E峰與雜峰分離良好。色譜圖見圖2。

3.2.2 對照品溶液和供試品溶液制備：精密稱取Tupistroside E對照品5.7 mg，置于10 ml 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度，配制成含Tupistroside E 0.57 mg/ml的溶液，經(jīng)0. 45 μm濾膜濾過，濾液作為對照品溶液。精密稱取竹根七粉末約0.5 g，放入具塞錐形瓶中，加入10 ml的60%甲醇水,稱重，超聲1 h(功率 250 W，頻率40 k Hz)后，再次稱重，放冷并補足重量，用0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

表1 梯度洗脫程序

圖2 對照品(A)與供試品溶液(B)的色譜圖

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密吸取Tupistroside E對照品溶液5，10，15，20，25，30，40 μL，每體積進(jìn)樣3次，按上述色譜條件測定峰面積。橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量質(zhì)量(X, μg), 縱坐標(biāo)為色譜峰面積( Y, AU ) ，進(jìn)行線性回歸。得對照品Tupistroside E的回歸方程 Y=184190X+8090.2，r=0.9996，線性范圍為2.85～ 23.00 μg。

3.2.4 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗：吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL進(jìn)樣，按照色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次，測定Tupistroside E峰面積，RSD為1.01%，結(jié)果表明儀器精密度良好；精密吸取供試品溶液20 μL，分別在0，1, 2，4，8, 16, 24 h 進(jìn)樣分析, 照色譜條件測定色譜峰峰面積，結(jié)果Tupistroside E峰面積的RSD為0.63%，表明樣品溶液在配制后24 h內(nèi)穩(wěn)定，取同一批次藥材，平行稱取6份，按方法制備供試品溶液, 照色譜條件測定Tupistroside E含量，結(jié)果表明本法重復(fù)性較好，RSD為1.17%。

3.2.5 加樣回收試驗：稱取已知含量的樣品9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入Tupistroside E對照品適量，制備供試品溶液, 照色譜條件測定Tupistroside E含量。計算回收率，結(jié)果見表2。樣品含量測定：稱取3種產(chǎn)地竹根七藥材粉末各3 份(過4號篩，低溫烘干至恒重)，每份約0.5 g，按照制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液15 μL，根據(jù)外標(biāo)法計算不同產(chǎn)地竹根七(紅河谷，漢中和鳳縣)中Tupistroside E的含量分別為3.078 %，3.010 % 和3.724 %(n=3)。

3.3 指紋圖譜研究

3.3.1 竹根七藥材樣品來源：10 批竹根七藥材編號S1 ～ S10，其中，S1 ～ S4 號采自陜西紅河谷，S5 號采自陜西鳳縣，S6產(chǎn)自甘肅西山、S7 產(chǎn)自陜西漢中、S8 產(chǎn)自陜西太白、S9 產(chǎn)自四川、S10 產(chǎn)自陜西眉縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為百合科開口箭屬植物開口箭Tupisra chiensis Baker.的干燥根及根莖。

表2 加樣回收率實驗

3.3.2 供試品溶液制備：精密稱取竹根七粉末(過5號篩)約0.5 g，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 ml，稱重，超聲處理(功率250 W，頻率 60 kHz)45 min，放冷，稱重，用甲醇補足重量，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，作為供試品溶液，即得。

3.3.3 色譜條件：色譜柱為 Thermo HyPURITY C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A相) 和水(B相)為流動相，梯度洗脫條件：0～25min, 15%→23%A, 25～30min, 23%→24%A,30～36min, 24%→24%A, 36～40min, 24%→28%A,40～55min, 28%→34%A,55～60min, 34%→40%A,60～64min, 40%→60%A,；柱溫為25℃；檢測波長為 203 nm；流速為1ml/min；進(jìn)樣量為10 μL。

3.3.4 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一樣品的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有峰與內(nèi)參比峰相對保留時間的RSD均低于0.3%，相對峰面積的RSD均低于3.0%。 表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的要求。取同一批藥材樣品6份，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按項下色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果各共有峰與內(nèi)參比峰的相對保留時間的RSD均低于0.3%，相對峰面積的RSD均低于3.0%，表明方法重現(xiàn)性良好。 精密吸取同一樣品的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣分析，結(jié)果各色譜峰相對保留時間的RSD均低于0.2%，相對峰面積的RSD均低于3.0%，符合指紋圖譜的要求，且各時間點色譜圖相似度均大于0.95，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.3.5 指紋圖譜建立：取10批不同產(chǎn)地的竹根七藥材樣品，約0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液制備”項下方法制備供試品溶液，按“色譜條件”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄 10批竹根七藥材的HPLC指紋圖譜。將其導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系2004A 版》軟件進(jìn)行分析，以陜西紅河谷竹根七樣品(S05)的指紋圖譜為參照圖譜，以平均數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.2s，經(jīng)多點校正、自動匹配后生成竹根七藥材指紋圖譜的共有模式R，并建立10批竹根七藥材的指紋圖譜，見圖3。

3.3.6 相似度評價：按國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)”比較樣品的色譜圖和計算相對保留時間，對10批樣品指紋圖譜采用多點校正后進(jìn)行自動匹生成對照圖譜，見圖4。計算10 批樣品的相似度，結(jié)果見表3。由相似度結(jié)果可知，以上樣品與對照譜相比較，除個別批次(如S5,S6,S9)外，其余相似度均達(dá)到0.88以上，藥材差異較小。

圖3 10批竹根七藥材的指紋圖譜圖4 竹根七共有峰HPLC標(biāo)準(zhǔn)圖譜

表3 10 批次樣品相似度評價

討 論

竹根七多年生草本，高25～50 cm。根莖連珠狀，粗1～1.5 cm。葉互生，具柄；葉片紙質(zhì)，卵形、橢圓形或長圓狀披針形，長4～9 cm，寬2.3～4.5 cm，先端漸尖，基部鈍、寬楔形或稍心形，兩面無毛[13-16]。花1～2朵生于葉腋，白色，內(nèi)帶紫色，稍俯垂；花梗長7～14mm；花被鐘形，長15～22 mm，花被筒長約為花被的2/5；副花冠裂片膜質(zhì)，與花被裂互生，卵狀披針形，長約5 mm，先端通常2-3齒或2淺裂；雌蕊長8～9 mm，花柱與子房近等長。漿果近球形，直徑7～14 mm，具2～8顆種子。花期4-5月，果期11月?？捎糜谥委焺趥L(fēng)濕疼痛，虛咳多汗，產(chǎn)后虛弱，腰痛遺精，夜尿頻多等癥?！蛾兾髦胁菟帯吩粸槌L(fēng)濕，清熱瀉火，鎮(zhèn)痛止血，調(diào)經(jīng)活血，滋陰補虛。治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腰腿疼痛，跌打損傷，勞傷，月經(jīng)不調(diào)，骨蒸勞熱。

不同流動相的考察。為了最佳分離指標(biāo)成分，分別用甲醇-水和乙腈-水等流動相體系進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)用乙腈-水洗脫基線平穩(wěn)，分離度較高。最終發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水體系，梯度(0～15 min, 15%～23% A; 15～33 min, 23%～38% A; 33～40 min, 38%～100% A; 40～45 min, 100%～100% A)洗脫，竹根七中主要成分甾體皂苷類化合物的色譜峰分離度最高。

液相檢測波長的確定[17-19]。竹根七皂苷的結(jié)構(gòu)類型主要為甾體皂苷，對不同的檢測波長進(jìn)行探索后發(fā)現(xiàn)該類化合物在紫外區(qū)末端有吸收，故本文選擇檢測波長λ=203 nm，在此色譜條件下，基線較為平穩(wěn)，色譜峰峰型較好，而且色譜峰能達(dá)到基線分離。

采用薄層色譜有快速、簡便等特點。在對實驗條件的系統(tǒng)考查基礎(chǔ)上確立了竹根七薄層色譜條件，考察了三氯甲烷- 甲醇- 水、三氯甲烷 - 甲醇、石油醚- 乙酸乙酯等不同比例的展開系統(tǒng)，且經(jīng)反復(fù)證明，薄層色譜(三氯甲烷：甲醇：水 =7：3：1) 下層液為展開劑展開，具有分離度高、斑點清晰、簡便易行等特點，可用于竹根七藥材的鑒別。3種產(chǎn)地竹根七中Tupistroside E含量測定結(jié)果來看，不同產(chǎn)地竹根七中Tupistroside E的含量有一定差異，其中陜西鳳縣最高，紅河谷其次，漢中最低。本實驗為其他成分的含量測定方法提供了參考。竹根七作為秦巴山區(qū)的道地藥材，是陜西“太白七藥”之一，被2015版《陜西省藥材標(biāo)準(zhǔn)》收錄，但它未采用高效液相法進(jìn)行含量測定，在薄層鑒別中選取的對照品具有一定局限性，本課題組在系統(tǒng)研究竹根七化學(xué)成分基礎(chǔ)上，對竹根七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了升級。該方法簡便快速，分離度好，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，專屬性強，此次薄層鑒別及高效液相含量測定方法可為竹根七質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供強大依據(jù)。