宋恭帥，張蒙娜，彭 茜，朱鳳仙，沈 清,2，戴志遠(yuǎn),2,*

（1.浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012；3.日本香川大學(xué)農(nóng)學(xué)部，日本 香川 高松 7610795）

魚油是n-3系列不飽和脂肪酸的主要來源，其對(duì)人體健康和疾病預(yù)防方面的作用在多年前就已被驗(yàn)證，尤其以二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）的生理活性最為突出[1]。EPA與DHA僅存在于水產(chǎn)品中，對(duì)增強(qiáng)人體神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及視覺的功能有著重要作用[2-3]。然而，n-3系列不飽和脂肪酸極易被氧化，導(dǎo)致魚油中營養(yǎng)成分流失并產(chǎn)生難聞的腥臭異味[4]。故魚油品質(zhì)與n-3系列不飽和脂肪酸含量及抗氧化穩(wěn)定性密切相關(guān)，且光線、溫度、空氣及金屬離子等外界環(huán)境的變化都會(huì)加速其氧化[5]。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)油脂抗氧化穩(wěn)定性及其品質(zhì)變化研究較多。Fontagné等[6]將魚油在50 ℃下鼓風(fēng)氧化48 h后，并測(cè)定其過氧化值，以模擬魚油動(dòng)態(tài)變化規(guī)律；結(jié)果表明，過氧化值隨氧化時(shí)間的延長而顯著升高（P＜0.05）。呂軍偉[7]通過將DHA藻油置于（60±1）℃的烘箱中存放12 d，并定期測(cè)定藻油的過氧化值、硫代巴比妥酸值及藻油中DHA殘留率，以研究DHA藻油的抗氧化穩(wěn)定性。然而目前對(duì)魚油在貯藏期品質(zhì)變化規(guī)律的研究較少，尤其是對(duì)在不同貯藏溫度下其穩(wěn)定性變化的研究更少?？紤]到實(shí)際生活中食品的貯藏條件，本實(shí)驗(yàn)選定35、25、15、5 ℃為溫度梯度進(jìn)行研究，通過將粗魚油與精制魚油分別置于不同溫度條件下，定期檢測(cè)其理化指標(biāo)（酸價(jià)、過氧化值與茴香胺值）、脂肪酸組成及揮發(fā)性風(fēng)味的變化，探究其在貯藏期品質(zhì)變化規(guī)律，為提高貯藏穩(wěn)定性和延長貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗制魚油（由金槍魚與鳀魚加工下腳料提煉制得）購于浙江舟山奧旭魚油制品有限公司。

脂肪酸甲酯（標(biāo)準(zhǔn)品） 美國Sigma公司；其他試劑均購于西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）涂層萃取頭 美國Supelco公司；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀 美國Agilent公司；Trace GC Ultra GC儀、DSQ II質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國Thermo Fisher Scientif i c公司；ROTINA 420R離心機(jī) 德國Hettich科學(xué)儀器公司；LRH-150-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

粗制魚油經(jīng)脫膠、脫酸、脫色和脫臭工藝[8-11]處理制得精制魚油。（主要工藝參數(shù)如下：酸法脫膠，體積分?jǐn)?shù)85%磷酸，添加量為油質(zhì)量的1%；堿法脫酸，約20 g/100 mL NaOH溶液，添加量（m/g）與樣品酸價(jià)有關(guān)（具體關(guān)系見式（1）～（3））；吸附脫色，活性白土用量約為油質(zhì)量的10%；真空脫臭）。并將粗制魚油與精制魚油分裝于200 mL帶蓋玻璃瓶中，各4 瓶，分別置于35、25、15、5 ℃恒溫箱中貯藏120 d。每隔15 d取樣測(cè)定樣品酸價(jià)、過氧化值、茴香胺值；每隔30 d取樣測(cè)定脂肪酸組成及揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化。為防止促進(jìn)魚油氧化，取樣時(shí)動(dòng)作盡量快速。

1.3.2 酸價(jià)的測(cè)定

參考GB 5009.229—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》[12]中的冷溶劑指示劑滴定法測(cè)定酸價(jià)。

1.3.3 過氧化值的測(cè)定

參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》[13]中的滴定法測(cè)定過氧化值。

1.3.4 茴香胺值的測(cè)定

參考GB/T 24304—2009《動(dòng)植物油脂 茴香胺值的測(cè)定》[14]中的方法測(cè)定茴香胺值。

1.3.5 脂肪酸組成分析

1.3.5.1 魚油甲酯化

稱取0.1 g魚油樣品于具塞試管中，加入2 mL 0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液，充分搖勻，65 ℃水浴加熱30 min，取出后自然冷卻，再加入2 mL 體積分?jǐn)?shù)15% BF3-CH3OH溶液，充分搖勻，65 ℃水浴加熱3 min，取出后自然冷卻，加入2 mL正己烷提取，同時(shí)加入2 mL飽和NaCl溶液水洗，靜置分層，取上層清液并加入1/10體積的無水Na2SO4去除溶液中痕量的水，將處理好的上層清液過有機(jī)相濾膜后用GC儀進(jìn)行脂肪酸相對(duì)含量測(cè)定[15]。

1.3.5.2 GC檢測(cè)

GC檢測(cè)條件：HP-88氰丙基色譜柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm）；載氣：H2；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)溫度220 ℃；程序升溫：起始柱溫設(shè)定為70 ℃，以15 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至175 ℃，保持10 min；最后以5 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

1.3.6.1 固相微萃取條件

稱取5 g樣品置于15 mL頂空進(jìn)樣瓶中，60 ℃下平衡10 min，并將老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS涂層萃取頭插入進(jìn)樣瓶頂空部分，60 ℃下吸附30 min，取出后插入GC進(jìn)樣口，250 ℃解吸3 min。

1.3.6.2 GC-MS檢測(cè)條件

GC條件：色譜柱為TR-35 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。

MS條件：離子源溫度200 ℃；電子離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)定性分析時(shí)，通過NIST 2.0譜庫做自動(dòng)檢索確認(rèn)定性，且僅當(dāng)正反匹配度（SI/RSI）均大于800（最大值為1 000）的鑒定結(jié)果才予以保留。定量分析時(shí)采用峰面積歸一化法求得各揮發(fā)性成分在樣品中的相對(duì)含量[16]，測(cè)定數(shù)據(jù)以±s表示。采用SPSS 21.0軟件Duncan檢驗(yàn)對(duì)脂肪酸相對(duì)含量的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚油貯藏過程中理化性質(zhì)的變化

圖1 粗制魚油（a）和精制魚油（b）在貯藏過程中的酸價(jià)變化Fig.1 Changesin acid values of crude (a) and refined (b) fish oil over time at different temperatures

圖2 粗制魚油（a）和精制魚油（b）在貯藏過程中的過氧化值變化Fig.2 Changes in peroxide values of crude (a) and refined (b) fish oilover time at different temperatures

圖3 粗制魚油（a）和精制魚油（b）在貯藏過程中茴香胺值的變化Fig.3 Changes in anisidine values of crude (a) and refined (b) fish oil over time at different temperatures

由圖1～3可知，在貯藏期內(nèi)，酸價(jià)、過氧化值、茴香胺值均顯著升高，且相同溫度條件下，粗制魚油與精制魚油間也存在較大差異。粗制魚油初始酸價(jià)為5.79 mg/g，過氧化值為0.98 mmol/kg，茴香胺值為6.18。經(jīng)精制處理后，大量游離脂肪酸、色素、部分脂類及揮發(fā)性成分等雜質(zhì)被有效清除[17]，使魚油品質(zhì)得到有效提升。該精制魚油初始酸價(jià)為0.65 mg/g，過氧化值為0.75 mmol/kg，茴香胺值為5.02。

在貯藏初期，分別置于35、25、15、5 ℃恒溫箱中的粗制魚油與精制魚油，其酸價(jià)、過氧化值及茴香胺值變化均不大，此時(shí)魚油正處于氧化誘導(dǎo)階段，穩(wěn)定性較好[18]。隨貯藏時(shí)間的延長，酸價(jià)、過氧化值和茴香胺值逐漸增大，且溫度越高，增幅越明顯，氧化作用越顯著。

酸價(jià)的高低與魚油中游離脂肪酸含量多少密切相關(guān)[19]。氧化作用導(dǎo)致油脂中酯鍵斷裂而產(chǎn)生大量游離脂肪酸，故魚油酸價(jià)升高。在35℃條件下，貯藏120 d時(shí)，粗制魚油酸價(jià)高達(dá)28.58 mg/g，遠(yuǎn)高于精制魚油。董小林等[20]研究發(fā)現(xiàn)，將魚油分別敞口置于室溫、30、45、60、100 ℃條件下貯藏56 d，在100 ℃條件下酸價(jià)變化最為顯著，初始時(shí)（0 d）其酸價(jià)為0.38 mg/g，貯藏56 d后，酸價(jià)上升至22.24 mg/g。而在本實(shí)驗(yàn)中，魚油均加蓋貯藏，具有良好的氣密性，且每次盡量快速取樣以避免魚油氧化。故在整個(gè)貯藏期間，魚油酸價(jià)變化不是特別大。

過氧化值是判斷魚油品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，其主要反映魚油中氫過氧化物的含量。氫過氧化物是油脂氧化產(chǎn)生的初級(jí)氧化產(chǎn)物。隨溫度升高，魚油氧化作用加劇，過氧化值變化更顯著；這是由于溫度對(duì)甘油三酯及其他物質(zhì)的異構(gòu)化、分解等有一定的誘導(dǎo)作用，且溫度越高，誘導(dǎo)速率越快[21]。在魚油氧化過程中，氫過氧化物的分解速率與其生成速率之間的關(guān)系也會(huì)影響過氧化值的變化規(guī)律。另外，氫過氧化物能被進(jìn)一步分解成小分子酮、醛類等次級(jí)氧化產(chǎn)物。

茴香胺值可表征油脂中醛、酮、醌等次級(jí)氧化產(chǎn)物含量的多少，主要表示油脂中醛類化合物的含量[22-23]。在貯藏期間，魚油茴香胺值的變化規(guī)律與過氧化值相似。在貯藏后期，在35 ℃條件下魚油茴香胺值的增長速率有所減緩，此現(xiàn)象在精制魚油中更為明顯，這與魚油中具有揮發(fā)性的次級(jí)氧化產(chǎn)物含量減少有關(guān)[24]。

此外，經(jīng)對(duì)比分析在不同貯藏溫度條件下粗制魚油與精制魚油酸價(jià)、過氧化值及茴香胺值的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)精制魚油的貯藏穩(wěn)定性較差，更易受環(huán)境條件影響，品質(zhì)破壞嚴(yán)重。這可能是由于精制過程中，在去除魚油中有害雜質(zhì)的同時(shí)也將部分抗氧化活性成分帶走，導(dǎo)致魚油自身抗氧化能力下降[25-26]。

2.2 魚油貯藏期判斷

根據(jù)魚油行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3502—2016《中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 魚油》[27]，以酸價(jià)和過氧化值作為一級(jí)魚油是否變質(zhì)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。一級(jí)與二級(jí)魚油理化指標(biāo)的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 魚油理化指標(biāo)[27]Table1 Physicochemical characteristics of fish oil[27]

精制魚油初始酸價(jià)為0.65 mg/g，過氧化值為0.75 mmol/kg；粗制魚油初始酸價(jià)為5.79 mg/g，過氧化值為0.98 mmol/kg，均達(dá)到一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。參照上述標(biāo)準(zhǔn)可知：35 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為20 d，粗制魚油約為40 d；25 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為40 d，粗制魚油約為65 d；15 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為65 d，粗制魚油約為80 d；5 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為115 d，而粗制魚油在120 d貯藏期內(nèi)未變質(zhì)。

2.3 脂肪酸組成變化

在整個(gè)貯藏期間，魚油中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）總含量增加，不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）總含量降低，使整體不飽和度下降。魚油中主要脂肪酸有肉豆蔻（C14∶0）、十五酸（C15∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、十七酸（C17∶0）、十七碳一烯酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亞油酸（C18∶2cis）、花生四烯酸（C20∶4）、EPA和DHA[28]。由表2可知，在35 ℃條件下，魚油主要脂肪酸相對(duì)含量變化最為顯著。貯藏后，粗制魚油與精制魚油中SFA總量分別增加了20.99%和30.81%，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）總量分別增加了19.94%和19.30%，而多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）總量則分別下降了46.15%和47.46%，其中EPA與DHA總量分別減少了36.60%和36.62%。魚油中PUFA較MUFA更易被氧化，其減少速率比MUFA快，而MUFA氧化成為SFA的速率又相對(duì)較慢，故使得MUFA占比增大。該結(jié)果與李文佳[18]研究的魚油貯藏過程中脂肪酸變化的趨勢(shì)相接近，即整個(gè)貯藏過程中，魚油中飽和脂肪酸總量增加而導(dǎo)致整體不飽和度下降。此外，精制魚油穩(wěn)定性更差，這與其理化指標(biāo)的變化規(guī)律相一致。由表3～5可知，隨著貯藏溫度的降低，魚油中脂肪酸相對(duì)含量變化不大。故低溫條件能有效保護(hù)魚油品質(zhì)，延長貯藏期。

表2 35 ℃貯藏條件下粗制魚油與精制魚油在貯藏過程中主要脂肪酸相對(duì)含量的變化Table2 Changes in relative contents of main fatty acids in crude and refined fish oil over time at 35 ℃%

表3 25 ℃貯藏條件下粗制魚油與精制魚油主要脂肪酸相對(duì)含量隨時(shí)間的變化Table3 Changes in relative contents of main fatty acids in crude and refined fish oil over time at 25 ℃%

表4 15 ℃貯藏條件下粗制魚油與精制魚油主要脂肪酸相對(duì)含量隨時(shí)間的變化Table4 Changes in relative contents of main fatty acids in crude and refined fish oil over time at 15 ℃ storage condition%

表5 5 ℃貯藏條件下粗制魚油與精制魚油主要脂肪酸相對(duì)含量隨時(shí)間的變化Table5 Changes in relative contents of main fatty acids in crude and refined fish oil over time at 5 ℃ storage condition%

2.4 揮發(fā)性成分的變化

魚油揮發(fā)性成分主要由醛、醇、酮、酸和烴類組成。醛類化合物主要源自不飽和脂肪酸的氧化降解[29]，其感覺閾值一般都很低，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)大[30]；醇類一般被認(rèn)為是羰基化合物還原或是脂肪酸二級(jí)氫過氧化物降解而生成[31]；酮類化合物來源于不飽和脂肪酸的熱氧化降解等作用[32]；而烴類化合物則可能是由于烷基自由基的自氧化作用產(chǎn)生，各種烴類（C8～C20）的感覺閾值通常較高，對(duì)魚油整體風(fēng)味幾乎沒有作用。

圖4 35 ℃貯藏條件下粗制魚油（a）與精制魚油（b）主要揮發(fā)性風(fēng)味成分隨時(shí)間的變化Fig.4 Changes in main volatile flavor components in crude (a) and refined (b) fish oil over time at 35 ℃

圖5 25 ℃貯藏條件下粗制魚油（a）與精制魚油（b）主要揮發(fā)性風(fēng)味成分隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes in main volatile flavor components in crude (a) and refined (b) fish oil over time at 25 ℃

圖6 15 ℃貯藏條件下粗制魚油（a）與精制魚油（b）主要揮發(fā)性風(fēng)味成分隨時(shí)間的變化Fig.6 Changes in main volatile flavor components in crude (a) and refined (b) fish oil over time at 15 ℃condition

圖7 5 ℃貯藏條件下粗制魚油（a）與精制魚油（b）主要揮發(fā)性風(fēng)味成分隨時(shí)間的變化Fig.7 Changes in main volatile flavor components in crude (a) and refined (b) fish oil over time at 5 ℃

由圖4～7可知，壬醛、1-戊烯-3-醇、己醛、十一醛、2-壬酮、苯甲醛、1-戊炔-3-醇、乙酸、丁酸、2-乙基己醇、2,5-二甲基呋喃及2-十一酮是粗魚油中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。隨貯藏時(shí)間延長，揮發(fā)性化合物總含量增加，且受溫度影響較大，溫度越高，其含量增加越多，變化越明顯。在貯藏前期，揮發(fā)性化合物的增長速率較慢，這與魚油過氧化值及茴香胺值在貯藏前期的變化規(guī)律趨近。到貯藏中期，由于脂肪酸氧化加劇致?lián)]發(fā)性氧化產(chǎn)物大量增加，魚油已產(chǎn)生較嚴(yán)重的脂肪酸敗味，并有較強(qiáng)的腥臭味。在整個(gè)貯藏期間，壬醛的含量變化最為顯著。壬醛是油酸氧化的主要特征產(chǎn)物，且感覺閾值為1 μg/kg，對(duì)魚油整體風(fēng)味貢獻(xiàn)很大，賦予魚油脂肪味[33]。1-戊烯-3-醇的含量變化也較明顯，閾值較小，是粗魚油中的主要腥味物質(zhì)[34]。己醛含量也隨著貯藏時(shí)間的延長而呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，其是亞油酸氧化的主要特征產(chǎn)物[35]。另外，2-壬酮、2,5-二甲基呋喃和2-十一酮的含量都明顯增加，且感覺閾值低，對(duì)魚油整體風(fēng)味貢獻(xiàn)大，而乙酸的含量可表征魚油氧化酸敗劇烈程度[24]。

粗魚油經(jīng)過脫膠、脫酸、脫色與脫臭處理后，大量膠脂類、色素、痕量金屬以及具有不良?xì)馕兜娜╊?、酮類、醇類和碳?xì)浠衔锏葥]發(fā)性成分被去除[36-38]，使得魚油風(fēng)味明顯改善。精制魚油中主要揮發(fā)性化合物有己醛、1-戊烯-3-醇、2,5-二甲基呋喃、己醇、2-庚酮、壬醛、十一醛、2-辛酮、2-乙基己醇、苯甲醇、2-壬酮、2-癸酮、2-十一酮、乙酸、丁醛和丙酸。由圖4可以看出，粗魚油經(jīng)精制處理后，其腥味物質(zhì)含量明顯減少，魚油品質(zhì)明顯提升。精制魚油中揮發(fā)性成分含量的變化規(guī)律與粗魚油相近，受溫度影響大。在貯藏前期，風(fēng)味物質(zhì)的含量變化不大，即處于氧化誘導(dǎo)階段。隨著時(shí)間延長，精制魚油氧化酸敗嚴(yán)重，己醛、1-戊烯-3-醇、壬醛及乙酸的含量顯著提高，且含量遠(yuǎn)超于同溫度條件下粗魚油中該物質(zhì)的含量，說明在相同環(huán)境條件下，精制魚油比粗魚油的貯藏穩(wěn)定性更差，其主要原因是精制魚油中脂肪酸的不飽和度高，更易被氧化分解。

3 結(jié) 論

魚油在不同貯藏溫度條件下品質(zhì)變化規(guī)律顯著。隨溫度升高，酸價(jià)、過氧化值及茴香胺值均明顯升高；大量PUMA被氧化，使其含量減少，而SFA含量增加；壬醛、1-戊烯-3-醇、己醛等物質(zhì)含量增加使魚油有強(qiáng)烈的腥臭異味，溫度對(duì)其貯藏穩(wěn)定性的影響大，且精制魚油貯藏穩(wěn)定性較粗制魚油差。35 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為20 d，粗制魚油約為40 d；25 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為40 d，粗制魚油約為65 d；15 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為65 d，粗制魚油約為80 d；5 ℃時(shí)精制魚油的保質(zhì)期約為115 d，而粗制魚油在120 d的貯藏期內(nèi)未變質(zhì)。對(duì)于如何更好地提高魚油貯藏穩(wěn)定性將是一個(gè)新的研究方向；在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將研究通過添加抗氧化劑、氣調(diào)貯藏、調(diào)節(jié)溫度等措施以期達(dá)到提高魚油貯藏穩(wěn)定性及延長貨架期的目的。