林通 張玉奇 李小悅

[摘要]目的 探討補中益氣湯聯(lián)合抗真菌藥物治療IC小鼠的有效性和可能機制。方法 60只雄性昆明小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺預處理后腹腔注射白念珠菌混懸液，制作IC小鼠模型。造模成功后隨機分為對照組（n=30）和實驗組（n=30）。兩組均給予抗真菌藥物灌胃治療，實驗組同時給予補中益氣湯[4 g/（kg·d）]灌胃，對照組同時給予等量生理鹽水灌胃。觀察兩組的第7天生存率；采用ELISA檢測IC小鼠肝組織、血清中的TNF-α、IL-6、IL-10表達；采用流式細胞儀檢測IC小鼠淋巴細胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的表達。結果 實驗組第7天的生存率顯著高于對照組（P<0.05）。實驗組IC小鼠肝組織和血清中IL-10均顯著低于對照組（P<0.05）；兩組IC小鼠肝組織和血清中的TNF-α、IL-6表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實驗組IC小鼠淋巴細胞亞群中CD4+/CD8+比值顯著高于對照組（P<0.05）；兩組IC小鼠淋巴細胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論 補中益氣湯聯(lián)合抗真菌藥物可以提高IC小鼠第7天的生存率，可能與提高細胞免疫功能和降低免疫抑制的發(fā)生有關。

[關鍵詞]侵襲性念珠菌??；補中益氣湯；有效性；細胞因子

[中圖分類號] R519.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）8（c）-0047-04

[Abstract] Objective To investigate the effectiveness and possible mechanism of Buzhongyiqi Decoction combined with anti-fungal agents treating invasive candidiasis. Methods Sixty male Kunming mice were pretreated with CTX and then injected with Candida albicans suspension in abdominal cavity， the IC mice model was made. After modeled successfully， they were randomly divided into control group （n=30） and experimental group （n=30）. Two groups were given anti-fungal therapy， while mice in the experimental group were given Buzhongyiqi Decoction of 4 g/（kg·d）and the control group was given the same amount of normal saline. The survival rate in the seventh day in the two groups were observed. The expressions of TNF-α， IL-6 and IL-10 in liver tissues and serum of IC mice were detected by ELISA. The expressions of CD3+， CD4+， CD8+ and CD4+/CD8+ in lymphocyte subsets of IC mice were detected by flow cytometry. Results The survival rate in the seventh day of the experimental group was significantly higher than that of the control group （P<0.05）. The expressions of IL-10 in liver tissue and serum of IC mice in the experimental group were significantly lower than those of the control group （P<0.05）. There were no significant difference in liver tissue and serum on expressions of TNF-αand IL-6 in IC mice between the two groups （P>0.05）. The ratio of CD4+/CD8+ in lymphocyte subsets of IC mice in the experimental group were significantly higher than that of the control group （P<0.05）. There were no significant difference of CD3+， CD4+ and CD8+ expressions in lymphocyte subsets of IC mice between the two groups （P>0.05）. Conclusion Buzhongyiqi Decoction combined with anti-fungal agents can improve the survival rate in the seventh day of IC mice， which may be related to the enhancement of cellular immune function and the reduction of immunosuppression.

[Key words] Invasive candidiasis； Buzhongyiqi Decoction； Effectiveness； Cytokine

近年來，由于廣譜抗生素和免疫抑制藥物的使用、器官移植及有創(chuàng)導管技術的開展，侵襲性念珠菌?。╥nvasive candidiasis，IC）的發(fā)病率不斷上升，正越來越受到臨床重視[1]。我們的前期研究顯示，免疫功能低下參與IC的發(fā)生、發(fā)展，提高免疫功能可以改善IC小鼠的預后[2]。作為臨床治療脾虛證的經(jīng)典方劑之一，補中益氣湯具有補中益氣、升陽舉陷的功效[3]。已有基礎研究證實，補中益氣湯可提高脾氣虛動物模型的免疫功能[4]。本研究擬探討補中益氣湯聯(lián)合抗真菌藥物治療IC動物模型的有效性和可能機制，為補中益氣湯應用于IC的臨床治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物及模型的建立

選取60只雄性昆明小鼠[許可證編號：SCXK（粵）2009-0011]，體重20～25 g，由中山大學實驗動物中心提供。

實驗開始前2 d給予環(huán)磷酰胺200 mg/kg預處理，實驗開始前1 d給予環(huán)磷酰胺100 mg/kg預處理，實驗開始后第4天給予環(huán)磷酰胺200 mg/kg復制免疫缺陷小鼠模型。將白念珠菌（沙保弱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h）配制標準混懸液（1×109 cfu/ml），采用腹腔注射白念珠菌混懸液的方法，制作IC小鼠模型[5-6]。

1.2主要試劑

中藥復方為黃芪30 g，升麻6 g，柴胡6 g，邊條參10 g，炙甘草15 g，當歸6 g，橘皮6 g，白術10 g。所有藥材均購自廣州市藥材市場，經(jīng)鑒定為合格品。生藥加適量水浸泡30 min，煎煮2次（分別為1.5 h和1 h），將濾液混合并濃縮至補中益氣湯1 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞，H32020857）；白念珠菌（由中山大學中山醫(yī)學院微生物學教研室提供，ATCC90028）；伊曲康唑口服液（比利時楊森，H20130425）；ELISA試劑盒（美國R&D; system公司，批號：20175244231）；FITC熒光抗體（美國Pharmingen公司，批號：201564587）。

1.3實驗分組及處理

將造模成功的60只雄性昆明小鼠隨機分為對照組和實驗組，每組30只。對照組和實驗組均給予抗真菌藥物灌胃治療（伊曲康唑口服液，50 mg/kg，Q12 h，稀釋成1 ml溶液）。實驗組同時給予補中益氣湯4 g/（kg·d）灌胃，對照組同時給予等量生理鹽水灌胃。動物模型建立后第7天處死實驗動物，取0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm腎組織勻漿，沙保弱培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，進行腎組織念珠菌菌落計數(shù)，以明確是否建模成功。采集肝組織標本儲存于-80℃冰箱備用[5-6]。

1.4觀察指標及檢測方法

兩組IC小鼠第7天生存率；實驗動物處死后取肝臟勻漿，取上清液；留取腹主動脈血0.5 ml。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測IC小鼠肝組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、IL-10表達；采用ELISA檢測IC小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的表達；采用流式細胞儀檢測IC小鼠淋巴細胞亞群中CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+表達。

1.5統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩組IC小鼠第7 天生存率的比較

實驗組IC小鼠第7 天累計死亡10只，對照組累計死亡18只。實驗組的第7天生存率（66.7%）顯著高于對照組（40.0%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.038）。

2.2兩組IC小鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-10表達的比較

實驗組IC小鼠肝組織中的IL-10表達顯著低于對照組（P<0.05）；兩組IC小鼠肝組織中的TNF-α、IL-6表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表1）。

2.3兩組IC小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10表達的比較

實驗組IC小鼠血清中的IL-10表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組IC小鼠血清中的TNF-α、IL-6比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

2.4兩組淋巴細胞亞群的比較

實驗組的CD4+/CD8+比值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組的CD3+、CD4+、CD8+比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表3）。

3討論

3.1 IC的發(fā)病機制

IC是臨床常見病、多發(fā)病，與有創(chuàng)操作、廣譜抗感染藥物的使用、慢性基礎疾病直接相關，常導致預后不良和治療費用增加[7]。念珠菌屬，尤其是最常見的白念珠菌，在生理狀態(tài)下定植在消化道，一旦出現(xiàn)創(chuàng)傷、應激等病理生理學改變，就會通過多種渠道播散感染，即發(fā)生侵襲性改變。目前臨床使用的抗真菌藥物以三唑類、棘白菌素類和多烯類為主，其作用靶點是破壞真菌細胞壁或細胞膜及其組分。隨著卡泊芬凈、伏立康唑等新型抗真菌藥物投入臨床，IC擺脫了既往治療藥物缺乏的尷尬境地，但IC治療效果仍不容樂觀，探索IC新的治療靶點已成為當前研究的熱點。

西醫(yī)和中醫(yī)對于IC的發(fā)病機制有相似的見解。通過大量臨床研究，鑒于念珠菌是機會致病菌的事實，目前西醫(yī)認為，免疫功能紊亂在IC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。T輔助淋巴細胞在組織相容性復合體Ⅱ（MHCⅡ）的限制下，分化為Thl和Th2兩類。Thl細胞可分泌IL-2、干擾素（IFN）、TNF、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等，通過炎癥級聯(lián)反應，促進吞噬、殺滅真菌；同時使細胞變性、壞死、血管通透性增加，導致組織和器官損傷。Th2細胞可分泌IL-4、IL-10等，通過刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，對真菌感染起調(diào)理素樣作用，同時抑制Thl細胞功能，使感染遷延[10-11]。淋巴細胞參與IC發(fā)病機制的表現(xiàn)在CD4+/CD8+比值的變化，已得到基礎和臨床研究的證實[2]。

中醫(yī)認為，IC的病機特點為本虛標實，邪盛正衰[10]。衛(wèi)氣發(fā)揮正氣防御外邪的作用，是肺、脾、腎功能協(xié)調(diào)旺盛的結果，即衛(wèi)氣化生于腎中之陽氣，充養(yǎng)于中焦脾胃，散布于肺氣的宣發(fā)，而三臟協(xié)調(diào)旺盛的關鍵又在于脾[12-13]。

中醫(yī)學認為，中醫(yī)脾與淋巴的免疫功能密切相關[12-14]?！镀⑽刚摗分赋觥皟?nèi)傷脾胃，百病由生”。脾不僅主運化水谷精微，為后天之本，還能行使防御功能。IC多因年老、久病、長期臥床、外傷等原因致肺脾虧虛，痰濕、痰熱等外邪乘虛而入，肺失宣降、脾失健運所致[10-15]。補中益氣湯為宋代李杲《內(nèi)外傷辨惑論》之方劑，具有補中益氣、升陽舉陷之功，是臨床上治療脾虛證的經(jīng)典方劑。研究表明，補中益氣湯可提高脾氣虛動物模型中的免疫器官指數(shù)，有助于提高免疫功能[12-16]。目前針對補中益氣湯治療脾虛動物模型的研究僅限于T淋巴細胞增殖能力和脾淋巴細胞抗氧化損傷，尚無將補中益氣湯用于治療IC動物模型的相關研究[11-17]。

3.2免疫調(diào)理治療與IC的綜合救治

基于抑制過度炎癥反應和提升細胞免疫的免疫調(diào)理一度是膿毒癥治療的希望，但存在以下幾點問題：膿毒癥范疇涵蓋內(nèi)外科疾病及其他基礎疾病，疾病一致性較差，不利于小樣本研究評價；免疫調(diào)理治療重在宏觀治療，即外周血炎癥指標和細胞免疫指標變化趨勢，但免疫調(diào)理治療的靶器官以及細胞和亞細胞結構功能是否發(fā)生改變尚難以有效評估。我們的前期研究結果顯示，補中益氣湯可以通過抑制氮化應激水平促進念珠菌病動物模型肝細胞線粒體的生物發(fā)生，降低氮化應激程度與肝細胞保護的相關作用，提示補中益氣湯可能促進IC動物模型的肝功能修復[13-18]。因此本研究通過以下設計，闡述觀點：補中益氣湯是否可以降低IC動物模型的死亡率；補中益氣湯是否可以減輕靶器官炎癥和全身炎癥反應綜合征；補中益氣湯是否可以改善IC動物模型中細胞的免疫功能。本研究結果顯示，實驗組IC大鼠第7天的生存率顯著高于對照組（P<0.05），實驗組IC大鼠肝組織和血清中的IL-10表達均顯著低于對照組（P<0.05），實驗組淋巴細胞亞群中CD4+/CD8+比值顯著高于對照組（P<0.05），提示補中益氣湯可以提高IC小鼠第7天生存率，可能與提高細胞免疫功能和降低免疫抑制的發(fā)生有關。

免疫調(diào)理治療闡釋了IC的重要發(fā)病機制，是IC治療的重要研究方向。本研究提示，補中益氣湯在IC治療中有一定的應用前景，其量效關系仍需進一步研究。

[參考文獻]

[1]朱丹婷，李景，俞立英.白色念珠菌致病性研究進展[J].中國真菌學雜志，2015，10（1）：54-58.

[2]李小悅，黃順偉，陳娟，等.烏司他丁聯(lián)合抗真菌藥物治療侵襲性念珠菌感染的實驗研究[J].中華普通外科學文獻（電子版），2013，7（4）：21-24.

[3]羅晶，顧紅纓，徐國憲.補中益氣湯對脾虛小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2006，16（17）：2613-2615.

[4]邢文婷，張李峰，程衛(wèi)東，等.含紅芪和含黃芪的補中益氣湯含藥血清對老齡小鼠脾淋巴細胞抗氧化損傷作用的比較[J].中藥材，2014，37（2）：299-302.

[5]李小悅，黃順偉，江智毅，等.烏司他丁對侵襲性念珠菌感染小鼠肝臟的保護作用及機制研究[J].中國急救醫(yī)學，2013， 33（10）：942-944.

[6]李小悅.烏司他丁對侵襲性念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護作用[J].中國當代醫(yī)藥，2016，23（15）：106-108.

[7]楊璐，馮文莉.光動力療法抗白色念珠菌感染的研究進展[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2016，10（20）：3107-3111.

[8]李小悅，陳娟，吳榮耀，等.谷氨酰胺聯(lián)合ω-3不飽和脂肪酸對膿毒癥患者炎癥反應和免疫功能的調(diào)節(jié)作用[J].廣東醫(yī)學，2011，32（17）：2315-2317.

[9]Pfaller MA，Diekema DJ.Epidemiology of invasive candidiasis：a persistent public health problem[J].Clin Microbiol Rev，2007，20（3）：133-163.

[10]阿米娜·阿不拉，斯拉甫·艾白，古力娜·達吾提，等.鞣花酸體外抗真菌活性及對小鼠白色念珠菌感染模型的治療作用研究[J].中國藥理學通報，2016，32（3）：399-403.

[11]羅晶，顧紅纓，徐國憲.補中益氣湯對脾虛小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2006，16（17）：2613-2615.

[12]劉春英，胡小萍，趙金茹，等.補中益氣湯對感染白色念珠菌小鼠免疫功能調(diào)節(jié)作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，1997，3（2）：19-20.

[13]林通，張玉奇，李小悅.補中益氣湯對念珠菌感染小鼠肝臟線粒體功能的保護作用[J].中國當代醫(yī)藥，2018，25（3）：117-119.

[14]李春云，遲誠，陰赪宏.侵襲性真菌病的治療[J].中國醫(yī)刊，2017，52（4）：10-13.

[15]趙蔚，孫芳.327例惡性血液病合并侵襲性真菌病患者的臨床分析[J].中國真菌學雜志，2017，12（6）：346-351.

[16]陳鍇，魯仁義，閻瀾.白念珠菌致病因素及抗真菌藥物研究進展[J].中國真菌學雜志，2017，12（3）：180-183.

[17]耿婉如，賀航詠，童朝暉.Th17細胞在侵襲性煙曲霉病中雙向調(diào)節(jié)作用的研究進展[J].中國真菌學雜志，2017，12（5）：312-317.

[18]肖喻，曹先偉.白假絲酵母菌基因分型方法的研究進展[J].中國感染控制雜志，2017，16（5）：482-486.