王舉，李婧，陳榮,*，沈瑩

1. 西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，西安 710055 2. 西安建筑科技大學(xué)建筑設(shè)計(jì)研究院，西安 710055

水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象是引發(fā)水華問(wèn)題的首要因素，在水體富營(yíng)養(yǎng)化過(guò)程中藍(lán)藻門(mén)的微囊藻是最為常見(jiàn)的一種有害藻種[1]，其繁殖速度較快，易在富營(yíng)養(yǎng)化水體中大量生長(zhǎng)且伴隨有藻毒素的產(chǎn)生。在對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題的研究中發(fā)現(xiàn)，氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽調(diào)控是最為可行有效的一種控制水華現(xiàn)象的方法[2-3]，其中營(yíng)養(yǎng)元素磷在控制淡水水體水華方面起著關(guān)鍵作用[4-6]。自然水體中藻細(xì)胞可直接吸收利用溶解性無(wú)機(jī)磷的含量很低，往往不能滿(mǎn)足藻細(xì)胞對(duì)磷的需求[7]，而溶解性有機(jī)磷可以作為藻類(lèi)利用的磷源促進(jìn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)在一些溶解性無(wú)機(jī)磷含量不足的湖水中溶解性有機(jī)磷是藍(lán)藻水華過(guò)程中主要的磷源[10]，藻細(xì)胞可通過(guò)合成堿性磷酸酶對(duì)部分溶解性有機(jī)磷水解從而補(bǔ)充磷源供藻細(xì)胞使用[11-12]。但通過(guò)對(duì)氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)控，水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題并沒(méi)有解決。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)微量元素對(duì)水華的形成也起到重要作用。微量元素鋅屬于過(guò)渡型金屬，是藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中所必需的微量元素之一，主要通過(guò)藻細(xì)胞表面的金屬結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)入藻細(xì)胞體內(nèi)[13]，在藻類(lèi)許多生理過(guò)程中起著重要作用，對(duì)藻類(lèi)的光合作用、生長(zhǎng)代謝以及藻細(xì)胞內(nèi)能量的產(chǎn)生都有一定影響[14]。鋅在許多酶系統(tǒng)中也起著重要作用，是堿性磷酸酶的輔助因子[15]，對(duì)堿性磷酸酶的生成有限制作用[16]。過(guò)高的鋅含量會(huì)影響細(xì)胞的增殖、光合作用以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收[17-18]，會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞的滲透性增加，使電解質(zhì)漏失，降低葉綠素含量，延長(zhǎng)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，促進(jìn)核酸的降解，使藻細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變異，甚至引起藻細(xì)胞的裂解死亡[19]。張鐵明等[20]在無(wú)機(jī)磷充足的條件下，研究發(fā)現(xiàn)低濃度鋅更有利于銅綠微囊藻的生長(zhǎng)；Zeng和Wang[21]在不同磷濃度條件下，研究藻細(xì)胞對(duì)鋅的吸收中發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻細(xì)胞中磷含量增加會(huì)促進(jìn)鋅的吸收；Lukac和Aegerter[22]研究發(fā)現(xiàn)鋅對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒也有促進(jìn)作用；雷振[23]在多種無(wú)機(jī)磷濃度條件下研究鋅對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)低無(wú)機(jī)磷條件下鋅元素對(duì)藻細(xì)胞增殖的作用更顯著。由于有機(jī)磷對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)有很大作用，但對(duì)于磷源與微量元素鋅共同作用對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的研究較少。本文主要致力于探討低磷濃度條件下，有機(jī)磷與微量元素鋅對(duì)微囊藻的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒產(chǎn)生影響，為抑制藍(lán)藻爆發(fā)，解決水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用藻種為產(chǎn)毒型銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，購(gòu)置于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，藻種編號(hào)為FACHB-912。采用BG-11培養(yǎng)基在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lux，光暗時(shí)間比為12 h:12 h。本研究選擇3種具有代表性磷：無(wú)機(jī)磷磷酸氫二鉀(K2HPO4)，小分子有機(jī)磷甘油磷酸鈉(C3H7Na2O6P·5.5H2O)和大分子有機(jī)磷卵磷脂(C40H82NO9P)，實(shí)驗(yàn)藥品均為國(guó)產(chǎn)科密歐分析純?cè)噭?/p>

1.2 培養(yǎng)基設(shè)置

培養(yǎng)基除氮、磷、鋅元素外，其他均依照BG-11的營(yíng)養(yǎng)條件來(lái)設(shè)置。由于再生水補(bǔ)水已經(jīng)成為當(dāng)前城市景觀水體補(bǔ)水的重要方式，因此氮濃度設(shè)置依據(jù)GB18918—2002中一級(jí)A排放標(biāo)準(zhǔn)來(lái)設(shè)定(TN≤15 mg·L-1)，實(shí)驗(yàn)中以NaNO3為氮源設(shè)置硝氮濃度為10 mg·L-1，分別以3種不同形態(tài)磷為磷源，總磷濃度設(shè)置為0.1 mg·L-1；鋅元素采用七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)配制，在課題組對(duì)西安市城市景觀水體的調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，微量元素鋅的含量相對(duì)較高從幾微克每升至幾百微克每升，雷振[23]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低磷(無(wú)機(jī)磷)條件下鋅的作用更加顯著，鋅的最佳作用濃度范圍在0.5 μg·L-1～5 μg·L-1，因此本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)濃度梯度，分別為0.5 μg·L-1、5 μg·L-1和50 μg·L-1。

1.3 饑餓及接種

將正常培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻種在25 ℃、6 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液后用15 mg·L-1的NaHCO3洗滌3次，將離心得到的藻細(xì)胞接種至饑餓處理的培養(yǎng)基(不含氮、磷、鋅元素)中培養(yǎng)7 d。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后按上述方法再次離心只留下藻細(xì)胞，并接入配制不同鋅濃度梯度培養(yǎng)基中，接種初始藻密度約為2×105cell·mL-1，初始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)液總體積為500 mL，培養(yǎng)瓶采用總?cè)莘e為1 000 mL的廣口錐形瓶。接種好的培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，設(shè)置3個(gè)平行樣；每天手動(dòng)搖培養(yǎng)瓶3～4次，并將其隨機(jī)放置以減少光強(qiáng)對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的影響。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 藻密度的測(cè)定和增長(zhǎng)率的計(jì)算

藻密度的測(cè)定采用細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀(Cellometer Auto T4，達(dá)科為，中國(guó))，每次測(cè)定取樣量為1 mL。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，從接種至結(jié)束每隔1 d測(cè)定一次藻密度。藻細(xì)胞比增長(zhǎng)率采用如下公式計(jì)算：μ=ln(Xt/X0)/t

式中，Xt為某一時(shí)間間隔終結(jié)時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)量，X0為某一時(shí)間間隔開(kāi)始時(shí)的藻細(xì)胞數(shù)量，t為某一時(shí)間間隔(d)，當(dāng)連續(xù)2 d的μ值小于5%時(shí)即認(rèn)為藻細(xì)胞停止生長(zhǎng)。

1.4.2 葉綠素a的測(cè)定

葉綠素a的測(cè)定采用乙醇提取法，每2 d測(cè)定一次，每次取10 mL藻液。將取出的藻液加入適量飽和碳酸鎂混勻后經(jīng)真空抽濾裝置抽濾，將濾紙用剪刀剪碎后加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇，置于4 ℃冰箱中，黑暗提取8～12 h，離心后取上清液經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定。具體的計(jì)算公式如下：

C=11.64(OD663-OD750)-2.16(OD645-OD750)+0.1(OD630-OD750)

1.4.3 堿性磷酸酶活性(APA)的測(cè)定[24-25]

取5 mL藻樣，加入已經(jīng)滅菌的比色管中，隨后加入1 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)，搖勻后加入1 mL反應(yīng)底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉(p-nitrophenyl phosphate, PNP-P, MP Blomedicals)。將比色管避光處理放在30 ℃的生化培養(yǎng)箱中，反應(yīng)6 h，用1 mL的0.5 mol·L-1的NaOH溶液來(lái)終止反應(yīng)。用紫外分光光度計(jì)在410 nm處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol, PNP)的產(chǎn)生量，并計(jì)算單位時(shí)間所產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚(nitrophenol, PNP)，并以此作為細(xì)胞APA的單位。

1.4.4 藻毒素(MC-LR)的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)藻毒素樣品購(gòu)置于Sigma(純度98%)，以GB/T 20466—2006中藻毒素的測(cè)定方法為標(biāo)準(zhǔn)，采用液相色譜裝置測(cè)定(LC-2000，日立，日本)藻毒素含量，分離柱尺寸為250 mm×4.6 mm (SB-C18，安捷倫，USA)。從培養(yǎng)第2天開(kāi)始每隔1天測(cè)定一次藻細(xì)胞胞內(nèi)藻毒素含量，第2天藻液取樣量為15 mL以后每次為10 mL，樣品的制備參考Long[26]的制備方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

文中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2010處理，各圖采用Origin9.1繪制，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS20.0，P值表明各組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，P<0.05有顯著性差異，P>0.05無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 微囊藻生長(zhǎng)狀況

從圖1可以看出，無(wú)機(jī)磷K2HPO4最有利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，大分子有機(jī)磷LEC對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最弱。以K2HPO4為磷源時(shí)，不同濃度的鋅含量并未對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，而當(dāng)以有機(jī)磷為磷源時(shí)，不同濃度的鋅含量對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響有顯著性差異。以小分子有機(jī)磷NaGly為磷源時(shí)，在鋅濃度(CZn2+)為0.5 μg·L-1時(shí)最有利藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，CZn2+為50 μg·L-1時(shí)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于CZn2+為5 μg·L-1時(shí)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況；以大分子有機(jī)磷LEC為磷源時(shí)，在CZn2+為0.5 μg·L-1時(shí)最有利藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，CZn2+為50 μg·L-1與CZn2+為5 μg·L-1時(shí)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況并無(wú)差異。磷是影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素，鋅在小分子有機(jī)磷NaGly條件下也會(huì)對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，鋅的作用與磷形態(tài)有關(guān)，藻細(xì)胞對(duì)磷的依賴(lài)要強(qiáng)于對(duì)鋅的依賴(lài)，而磷與鋅共同作用的效果顯著。

從圖2可以看出，在無(wú)機(jī)磷K2HPO4為磷源條件下，不同含量的鋅對(duì)葉綠素a的影響并不顯著；而在有機(jī)磷條件下，不同含量的鋅對(duì)葉綠素a產(chǎn)生了影響，其中以小分子有機(jī)磷NaGly為磷源時(shí)效果更顯著；研究發(fā)現(xiàn)小分子有機(jī)磷NaGly對(duì)藻細(xì)胞的光合作用和呼吸作用影響較大，其中甘油三磷酸是光合作用中碳循環(huán)的底物，可以促進(jìn)光合作用，而鋅是光合作用過(guò)程中許多酶的輔助因子，因此NaGly與微量元素鋅共同促進(jìn)藻類(lèi)葉綠素a產(chǎn)生的效果更顯著[27]。對(duì)藻密度與葉綠素a做相關(guān)性分析(表1)發(fā)現(xiàn)，高濃度鋅(CZn2+為50 μg·L-1)時(shí)，磷源越難被利用，藻密度與葉綠素a的相關(guān)性越弱；而低濃度鋅時(shí)，藻密度與葉綠素a的相關(guān)性和磷源被利用的難易程度之間無(wú)明顯規(guī)律。

圖1 銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)量變化Fig. 1 Cell density of M. aeruginosaNote: K2HPO4 is inorganic phosphorus; NaGly stands for small molecule organic phosphorus glycerin sodium phosphate; LEC stands for macromolecular organic phosphorus lecithin.

圖2 銅綠微囊藻葉綠素a濃度變化Fig. 2 Chlorophyll a concentration of M. aeruginosa

磷源Phosphorus source鋅濃度Zn concentration線性方程Linear relationshipR2P磷酸氫二鉀K2HPO4Zn2+=50 μg·L-1y =0.028x-0.0420.999P<0.01Zn2+=5 μg·L-1y =0.003x+0.0640.924P<0.01Zn2+=0.5 μg·L-1y =0.040x-0.1050.977P<0.01甘油磷酸鈉NaGlyZn2+=50 μg·L-1y =0.030x+0.0110.974P<0.01Zn2+=5 μg·L-1y =0.028x+0.0010.788P<0.05Zn2+=0.5 μg·L-1y =0.028x-0.0200.982P<0.01卵磷脂LECZn2+=50 μg·L-1y =0.041x-0.0270.683P<0.05Zn2+=5 μg·L-1y =0.036x+0.0030.844P<0.05Zn2+=0.5 μg·L-1y =0.059x-0.1730.897P<0.01

對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律作進(jìn)一步研究(圖3)發(fā)現(xiàn)，以無(wú)機(jī)磷K2HPO4為磷源時(shí)藻細(xì)胞的比增長(zhǎng)速率最大，其次是小分子有機(jī)磷NaGly，以大分子有機(jī)磷LEC為磷源時(shí)的比增長(zhǎng)速率最小，這與Shi等[28]的研究結(jié)果一致，無(wú)機(jī)磷條件下藻細(xì)胞的比增長(zhǎng)速率高于有機(jī)磷條件下的比增長(zhǎng)速率。以小分子有機(jī)磷NaGly為磷源，在CZn2+為50 μg·L-1和CZn2+為0.5 μg·L-1時(shí)，藻細(xì)胞的比增長(zhǎng)速率與無(wú)機(jī)磷條件下藻細(xì)胞的比增長(zhǎng)速率差異不大。在同一磷源條件下，不同含量的鋅對(duì)藻細(xì)胞比增長(zhǎng)速率的影響不同。以K2HPO4為磷源時(shí)，CZn2+為5 μg·L-1時(shí)比增長(zhǎng)速率最大，CZn2+為0.5 μg·L-1時(shí)比增長(zhǎng)速率最小，即適量的鋅可以激發(fā)藻細(xì)胞的活性，而鋅含量過(guò)高則會(huì)抑制藻細(xì)胞的活性，鋅含量過(guò)低不利于藻細(xì)胞活性的激發(fā)。以NaGly為磷源時(shí)，CZn2+為5 μg·L-1時(shí)比增長(zhǎng)速率最小，而CZn2+為50 μg·L-1與CZn2+為0.5 μg·L-1時(shí)藻細(xì)胞的比增長(zhǎng)速率都較大且二者差異性不大，即鋅含量過(guò)高或過(guò)低都有利于提升藻細(xì)胞的活性。以LEC為磷源時(shí)，隨著鋅含量的降低藻細(xì)胞的比增長(zhǎng)率在逐漸增加，即鋅含量越低藻細(xì)胞的活性越強(qiáng)。陳仕光等[29]研究發(fā)現(xiàn)，藻細(xì)胞對(duì)微量元素鋅的需求量少但敏感度高，但本次研究發(fā)現(xiàn)，不同磷源條件下不同含量鋅對(duì)藻細(xì)胞的作用特性不同，即磷與鋅共同影響著藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

2.2 APA的變化

堿性磷酸酶屬于誘導(dǎo)酶，只有在磷限制時(shí)才會(huì)被誘導(dǎo)激活[30-31]，其主要作用是為藻細(xì)胞提供可直接利用的磷，單細(xì)胞APA是評(píng)價(jià)堿性磷酸酶對(duì)有機(jī)磷水解效率的有效指標(biāo)。從圖4可以看出，不同磷源條件下，在培養(yǎng)周期內(nèi)，單個(gè)藻細(xì)胞的APA隨時(shí)間的增加在不斷降低，而起始階段單細(xì)胞APA降低較快，其原因可能是由于經(jīng)過(guò)饑餓處理的藻細(xì)胞對(duì)磷的需求較大，起始階段藻細(xì)胞處于快速增長(zhǎng)時(shí)期需要大量的磷來(lái)合成新的細(xì)胞物質(zhì)。同一磷源條件下不同含量的鋅對(duì)單細(xì)胞APA變化的影響并無(wú)顯著性差異。

不同磷源條件下培養(yǎng)初期APA有所差異，大分子有機(jī)磷LEC條件下的APA量最大，是無(wú)機(jī)磷K2HPO4與小分子有機(jī)磷NaGly條件下APA的2倍左右，即以大分子有機(jī)磷為磷源時(shí)堿性磷酸酶的活性會(huì)迅速提高[32]。Martin等[33]和Diaz等[34]研究發(fā)現(xiàn)，藻細(xì)胞攝磷和生長(zhǎng)是2個(gè)不同的過(guò)程，當(dāng)外源可利用磷含量較高時(shí)，藻細(xì)胞吸收的磷以聚磷的形式儲(chǔ)存在體內(nèi)；當(dāng)外源可利用磷含量不足時(shí)，藻細(xì)胞調(diào)節(jié)體內(nèi)響應(yīng)產(chǎn)生水解酶，部分水解酶在細(xì)胞外分解可利用的磷源，部分將體內(nèi)儲(chǔ)存的聚磷水解以供藻細(xì)胞的生長(zhǎng)需要。由于以大分子有機(jī)磷LEC為磷源時(shí)，藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)饑餓處理，可直接利用的磷源幾乎沒(méi)有，并且大分子有機(jī)磷LEC較難被水解，因此APA較高。小分子有機(jī)磷NaGly較易被水解，低活性的APA即可滿(mǎn)足磷源的供應(yīng)，無(wú)機(jī)磷條件下經(jīng)過(guò)饑餓處理的藻細(xì)胞，在培養(yǎng)初期2～3 h內(nèi)會(huì)大量吸磷，一直達(dá)到自身質(zhì)量的2%，以聚磷的形式儲(chǔ)存于體內(nèi)[35]，由于外源無(wú)機(jī)磷的含量較少，藻細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中可直接利用的磷含量有限，不能滿(mǎn)足藻細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)磷的需求，因此其APA較高。

圖3 微囊藻的生長(zhǎng)率(μ)Fig. 3 Growth rate (μ) of M. aeruginosa

圖4 3種磷源下單細(xì)胞堿性磷酸酶活性(APA)變化Fig. 4 Changes of single cell alkaline phosphatase activity (APA) in three phosphorus sources

圖5 單細(xì)胞平均APA變化Fig. 5 Cellular average APA changes

從圖5可以看出，大分子有機(jī)磷LEC條件下單細(xì)胞平均APA是無(wú)機(jī)磷K2HPO4與小分子有機(jī)磷NaGly條件下的2倍左右。同一磷源條件下不同含量的鋅對(duì)單細(xì)胞平均APA的影響不同，無(wú)機(jī)磷K2HPO4條件下，隨著鋅含量的降低單細(xì)胞平均APA在逐漸升高。大分子有機(jī)磷LEC條件下，隨著鋅含量的降低單細(xì)胞平均APA在逐漸降低且差異性較大，這與Shi等[36]研究結(jié)果一致，在一定濃度范圍內(nèi)鋅含量的增加會(huì)促進(jìn)APA的增加。在小分子有機(jī)磷NaGly條件下鋅含量的改變并未對(duì)單細(xì)胞平均APA產(chǎn)生顯著影響。鋅是堿性磷酸酶的組成成分之一[14]，在細(xì)胞內(nèi)易與聚磷結(jié)合[37]，藻細(xì)胞內(nèi)的聚磷與細(xì)胞外可直接利用的磷含量有關(guān)，有機(jī)磷的水解與APA有關(guān)。K2HPO4可以被藻細(xì)胞直接吸收利用，高含量的鋅對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生限制作用，因此單細(xì)胞平均APA也受到限制；有機(jī)磷條件下，鋅會(huì)促進(jìn)堿性磷酸酶的產(chǎn)生，NaGly易被水解因此對(duì)單細(xì)胞平均APA的影響不顯著，LEC為大分子有機(jī)磷較難被水解，鋅含量越高對(duì)單細(xì)胞平均APA的促進(jìn)作用越顯著。不同磷源下鋅含量的變化對(duì)APA的影響并不相同，即微量元素鋅與磷的共同作用影響APA的產(chǎn)生。

2.3 藻細(xì)胞產(chǎn)毒狀況

2.3.1 不同磷源條件下的單個(gè)藻細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)毒量

本次主要研究藻毒素MC-LR在銅綠微囊藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的變化。單個(gè)藻細(xì)胞的胞內(nèi)產(chǎn)毒量是評(píng)價(jià)藻細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中生成藻毒素的一個(gè)重要指標(biāo)，它能更直觀地反映出環(huán)境因素對(duì)于藻細(xì)胞產(chǎn)毒的影響。從圖6可以看出，不同磷源條件下單個(gè)藻細(xì)胞的產(chǎn)毒量差異性較大，無(wú)機(jī)磷K2HPO4與小分子有機(jī)磷NaGly有利于藻毒素的產(chǎn)生，而大分子有機(jī)磷LEC條件下單個(gè)藻細(xì)胞的產(chǎn)毒量較低。

同一磷源條件下不同含量的鋅對(duì)單個(gè)藻細(xì)胞產(chǎn)毒量的影響不同，以無(wú)機(jī)磷K2HPO4為磷源時(shí)，CZn2+為5 μg·L-1時(shí)藻細(xì)胞的產(chǎn)毒量最大，CZn2+為50 μg·L-1時(shí)藻細(xì)胞的產(chǎn)毒量最少，即鋅含量過(guò)高對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)毒的抑制作用較強(qiáng)，鋅屬于過(guò)渡型金屬，主要通過(guò)藻細(xì)胞表面的金屬結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)入藻細(xì)胞體內(nèi)參與細(xì)胞的新陳代謝[13]。關(guān)于重金屬對(duì)藻類(lèi)的致毒機(jī)理發(fā)現(xiàn)，藻細(xì)胞壁帶有負(fù)電荷并且含有一些含硫、氮和氧的官能團(tuán)，重金屬易與細(xì)胞壁產(chǎn)生電荷吸引而且可與細(xì)胞壁上的官能團(tuán)發(fā)生螯合作用，使重金屬沉積在藻細(xì)胞表面并通過(guò)細(xì)胞的生理過(guò)程將重金屬吸收，從而對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝以及酶的活性產(chǎn)生影響[38]，并且過(guò)高的鋅含量會(huì)使細(xì)胞膜改性[39]，引起藻細(xì)胞滲透性的增加使電解質(zhì)漏失[19]，而鋅含量不足時(shí)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)毒的影響較弱。

以小分子有機(jī)磷NaGly為磷源時(shí)，CZn2+為50 μg·L-1和CZn2+為0.5 μg·L-1時(shí)有利于藻毒素的產(chǎn)生，二者之間的差異性不大，CZn2+為5 μg·L-1時(shí)藻細(xì)胞的產(chǎn)毒量最少。由于藻毒素的產(chǎn)生與藻細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān)，藻細(xì)胞經(jīng)過(guò)饑餓處理，起始階段可直接利用的磷幾乎沒(méi)有。CZn2+為0.5 μg·L-1時(shí)，鋅含量較少主要用于合成堿性磷酸酶，促進(jìn)有機(jī)磷的水解，有利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)毒也較多；CZn2+為50 μg·L-1時(shí)，鋅含量較多不僅堿性磷酸酶產(chǎn)量增加并且大量的鋅進(jìn)入藻細(xì)胞體內(nèi)，使藻細(xì)胞體內(nèi)的鋅含量超過(guò)閾值，藻細(xì)胞啟動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制，使體內(nèi)的聚磷與鋅結(jié)合并排出體外，藻細(xì)胞處于磷限制狀態(tài)，因此限制了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，產(chǎn)毒也減少；CZn2+為5 μg·L-1時(shí)，鋅促進(jìn)了堿性磷酸酶的產(chǎn)生并且進(jìn)入到藻細(xì)胞體內(nèi)，但由于NaGly較易被水解吸收，鋅含量的增加可能并未超過(guò)藻細(xì)胞體內(nèi)的閾值，因此并未啟動(dòng)響應(yīng)機(jī)制，但鋅的累積對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，產(chǎn)毒也較少。以大分子有機(jī)磷LEC為磷源時(shí)，隨著鋅含量的減少藻細(xì)胞的產(chǎn)毒量逐漸增加，即低含量的鋅更有利于藻毒素的產(chǎn)生。大分子有機(jī)磷較難被水解，較低含量的鋅有可能會(huì)對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此鋅含量越低越有利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，藻細(xì)胞產(chǎn)毒也就逐漸增加。

綜上所述，藻毒素的產(chǎn)生不僅與磷有關(guān)而且與鋅的含量有關(guān)，磷源與微量元素鋅共同影響著藻細(xì)胞的產(chǎn)毒，關(guān)于有機(jī)磷與鋅的共同作用對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)毒的作用機(jī)理還需做進(jìn)一步研究。

2.3.2 不同磷源條件下葉綠素a與藻毒素的相關(guān)性分析

如表2所示，對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(藻細(xì)胞比增長(zhǎng)率大于5%的階段)的葉綠素a含量與胞內(nèi)藻毒素含量做相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同磷源與不同鋅濃度條件下，藻細(xì)胞在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)葉綠素a含量與藻毒素(MC-LR)相關(guān)性不同。無(wú)機(jī)磷條件下葉綠素a與藻毒素呈現(xiàn)正相關(guān)性且相關(guān)系數(shù)較高，這與段靜波等[40]研究結(jié)果一致，而有機(jī)磷條件下葉綠素a與藻毒素之間相關(guān)性較弱。對(duì)在達(dá)到最大藻毒素含量之前的胞內(nèi)藻毒素含量與葉綠素a進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)磷與有機(jī)磷條件下葉綠素a與胞內(nèi)藻毒素的相關(guān)性較強(qiáng)，即藻細(xì)胞生長(zhǎng)初期，藻毒素與葉綠素a同步增加，隨著藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，胞內(nèi)藻毒素先于葉綠素a衰減。因此，在無(wú)機(jī)磷為磷源的條件下可以通過(guò)葉綠素a的含量對(duì)藻毒素含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，但有機(jī)磷源條件下，二者相關(guān)性較弱。

微量元素鋅與營(yíng)養(yǎng)元素磷普遍共存于城市水體中，本研究發(fā)現(xiàn)，磷源是影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，鋅含量也會(huì)對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響但作用相對(duì)較弱，而小分子有機(jī)磷NaGly與鋅的共同作用對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用顯著。磷源與鋅的共同作用對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)毒也會(huì)產(chǎn)生顯著影響，適量的鋅在小分子有機(jī)磷NaGly為磷源時(shí)有利于藻細(xì)胞的產(chǎn)毒，而以大分子有機(jī)磷LEC為磷源時(shí)，鋅含量越低越有利于藻細(xì)胞的產(chǎn)毒。

小分子有機(jī)磷與鋅的共同作用對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響比較顯著，在一定條件下比無(wú)機(jī)磷和鋅共同作用對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響效果更顯著。因此，對(duì)以小分子有機(jī)磷為主要磷源水體的富營(yíng)養(yǎng)化應(yīng)更多關(guān)注其與微量元素鋅共同作用的影響。

圖6 單細(xì)胞的產(chǎn)毒量Fig. 6 Cellular microcystin yield

磷源Phosphorus source鋅濃度Zn concentration線性方程Linear relationshipR2P磷酸氫二鉀K2HPO4Zn2+=50 μg·L-1y =16.2x-1.540.874P<0.01Zn2+=5 μg·L-1y =30.3x-1.780.823P<0.05Zn2+=0.5 μg·L-1y =11.8x+1.470.728P<0.01甘油磷酸鈉NaGlyZn2+=50 μg·L-1無(wú)相關(guān)性(No correlation)-P>0.05Zn2+=5 μg·L-1無(wú)相關(guān)性(No correlation)-P>0.05Zn2+=0.5 μg·L-1y =32.5x-2.890.897P<0.01卵磷脂LECZn2+=50 μg·L-1y =13.6x-2.020.700P<0.05Zn2+=5 μg·L-1無(wú)相關(guān)性(No correlation)-P>0.05Zn2+=0.5 μg·L-1無(wú)相關(guān)性(No correlation)-P>0.05