趙煥煥，庚天琦，張燕，張旸

哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，哈爾濱 150081

隨著抗草甘膦(glyphosate)轉(zhuǎn)基因作物在全球大面積種植，草甘膦已成為全球應(yīng)用最廣泛、使用量最大、除草效果最好的除草劑，從而使其在土壤、空氣、水源、食品中殘留越來越多，給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來潛在危害[1-3]。長期接觸草甘膦會損傷機體的肝臟、腎臟、神經(jīng)、生殖等系統(tǒng)[4-5]。孕鼠暴露于草甘膦能引起后代雄性大鼠的激素和組織的生殖參數(shù)改變，從而影響雄性生殖發(fā)育[6]。給予青春期前的Wistar雄性大鼠草甘膦，會延緩其進入青春期，引起睪丸功能和組織形態(tài)異常[7]。Cavalli等[8]研究揭示草甘膦導致的雄性生殖毒性的分子機制是睪丸和附睪的Ca2+介質(zhì)細胞凋亡引起的。流行病學調(diào)查顯示夫妻雙方暴露于草甘膦會降低受孕率，孕婦出現(xiàn)早產(chǎn)和自然流產(chǎn)的情況增加[9-10]。睪酮(testosterone, T)是促進男性內(nèi)外生殖器發(fā)育，維持男性性功能及第二性征，促進精子的發(fā)生和成熟的重要雄性激素[11]。血清中T的合成和分泌主要由下丘腦-垂體-性腺軸(HPT)控制，下丘腦能夠釋放促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)的釋放，F(xiàn)SH、LH、GnRH以及雌二醇(estradiol, E2)之間通過相互作用共同調(diào)節(jié)和維持著T的正常生理水平[12]。在T合成的過程中，任何蛋白受損都可導致性激素合成水平的下降或中斷。本研究對SD雄性大鼠進行經(jīng)口草甘膦亞慢性染毒，檢測大鼠血清中性激素含量和T合成中相關(guān)蛋白，探討草甘膦對雄性大鼠的生殖毒性，為評價草甘膦的毒性和防治措施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

95%草甘膦原粉購自金宇化工公司；羧甲基纖維素(色譜級)購自上海瑞永生物科技有限公司；HBSS(含鈣鎂，不含酚紅，試劑級)購自北京索萊寶生物科技有限公司；碘[125I]雌二醇放射免疫試劑盒、碘[125I]促卵泡生成激素放射免疫試劑盒、碘[125I]黃體生成激素放射免疫試劑盒、碘[125I]睪酮放射免疫試劑盒均購自北京北方生物技術(shù)研究所；兔抗大鼠P450scc多抗(Anti-P450scc)、兔抗大鼠3β-HSD多抗(Anti-3β-HSD)、兔抗大鼠StAR多抗(Anti-StAR)、兔抗大鼠17β-HSD多抗(Anti-17β-HSD)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司，DH5000 A型)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司，JA2003)；高速冷凍離心機(HERMLE LABORTECHNIK Z323K, Germany)；放免儀(西安核儀廠，xh6080)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處置

SPF級雄性SD大鼠120只購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號：SCXK (京)2016-0011)，體重80～120 g，清潔級維持飼料購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司(許可證號：SCXK (京)2014-0010)。大鼠飼養(yǎng)在溫度(22±2) ℃，相對濕度50%～60%，光照12 h明、12 h暗屏障環(huán)境中。大鼠按體重隨機分為4組，即對照組(1%羧甲基纖維素)，低劑量組(50 mg·kg-1草甘膦+1%羧甲基纖維素)，中劑量組(200 mg·kg-1草甘膦+1%羧甲基纖維素)，高劑量組(800 mg·kg-1草甘膦+1%羧甲基纖維素)，連續(xù)灌胃染毒，自由飲水。染毒第4周、8周和12周分別處死一批動物，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采集血液分離血清，摘取睪丸組織，用于蛋白表達水平檢測和病理組織學檢查。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 血清中激素水平測定

FSH、LH、T、E2水平檢測按試劑盒說明書操作，采用競爭性放射免疫分析法。將放射性標記抗原和非標記抗原和非標記待測抗原同時與限量特異抗體進行競爭結(jié)合反應(yīng)，通過分離未結(jié)合的標記抗原，測定標記抗原-抗體復(fù)合物的放射性計數(shù)，利用標準曲線和RIA的數(shù)學模型計算樣品中待測物質(zhì)的含量。

1.2.2.2 睪酮合成相關(guān)蛋白表達水平檢測

17β-HSD、3β-HSD、StAR和P450scc表達水平檢測均采用免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法)，具體程序為：烤片；常規(guī)二甲苯脫蠟；乙醇梯度脫水；阻斷，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；抗原修復(fù)；羊血清工作液封閉；滴加一抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育，PBS沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育，PBS沖洗；DAB/H2O2反應(yīng)染色，水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

免疫組化結(jié)果判定采用九分法(總分=染色強度×染色面積)。其中染色強度評分：0～3分別為無、輕度、中度、重度染色；染色面積評分：0～3分別為陽性細胞比率小于5%、5%～25%、25%～50%、大于50%。

1.3 統(tǒng)計分析

結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析和析因設(shè)計的方差分析，并進行染毒組與對照組間比較，P<0.05表示染毒組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，P>0.05表示染毒組與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 草甘膦對大鼠睪丸臟體比的影響

隨著染毒劑量增加，大鼠睪丸臟體比逐漸升高，第12周高劑量組睪丸臟體比與對照組相比，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗結(jié)果見表1。

2.2 草甘膦對大鼠睪丸組織形態(tài)的影響

染毒12周，對照組和低劑量組睪丸生精小管基膜完整，各級細胞排列規(guī)則，無壞死脫落現(xiàn)象，間質(zhì)結(jié)構(gòu)完整(圖1A和B)。中劑量組生精小管基膜完整，但各級生精細胞排列紊亂、疏松，部分細胞脫落至管腔內(nèi)，間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)疏松(圖1C)。高劑量組生精小管部分基膜斷裂，各級生精細胞排列紊亂、疏松，甚至脫落至管腔內(nèi)，伴隨部分間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，睪丸組織水腫(圖1D、E)。

圖1 睪丸組織病理學改變(HE×200)注：A對照組，B低劑量組，C中劑量組，(D、E)高劑量組。生精細胞排列紊亂、疏松；間質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞；水腫。Fig. 1 Pathological changes of testis (HE×200) Note: A, Control group; B, Low dose group; C, Middle dose group; (D, E), High dose group. Permutation and loosening of spermatogenic cells; structural damage of interstitial area; edema.

劑量組Dose group4周 Four weeks8周Eight weeks12周Twelve weeks對照組 Control group0.83±0.080.77±0.080.66±0.04低劑量組 Low dose group0.82±0.140.76±0.110.69±0.07中劑量組 Middle dose group0.87±0.100.74±0.040.71±0.05高劑量組 High dose group0.90±0.040.72±0.090.75±0.07?

注：*P< 0.05，與對照組相比有統(tǒng)計學意義。

Note： *P< 0.05, compared with the control group, statistically significant.

圖3 草甘膦對StAR表達的影響(HE×200)注：E對照組，F(xiàn)低劑量組，G中劑量組，H高劑量組。Fig. 3 Effect of glyphosate on StAR expression (HE×200)Note: E, Control group; F, Low dose group; G, Middle dose group; H, High dose group.

劑量組Dose group時間Time卵泡刺激素/(mIU·mL-1)Follicule-stimulating hormone (FSH)/(mIU·mL-1)黃體生成素/(mIU·mL-1)Luteinizing hormone (LH)/(mIU·mL-1)睪酮/(ng·mL-1)Testosterone (T)/(ng·mL-1)雌二醇/(pg·mL-1)Estradiol (E2)/(pg·mL-1)對照組Control group4周 4 weeks1.69±0.332.08±0.981.81±0.6515.47±4.548周 8 weeks1.71±0.452.54±0.864.12±0.6713.31±4.5512周 12 weeks1.66±0.391.55±0.383.38±0.3713.90±9.15低劑量組Low dose group4周 4 weeks1.64±0.662.22±0.771.61±0.3813.64±5.288周 8 weeks1.69±0.262.28±1.003.64±0.6813.29±5.4312周 12 weeks1.65±0.182.24±0.343.12±0.3311.54±4.39中劑量組Middle dose group4周 4 weeks1.60±0.472.36±0.841.47±0.9612.70±3.028周 8 weeks1.68±0.362.18±0.723.63±0.3913.23±3.0812周 12 weeks1.63±0.502.10±0.722.51±0.38?11.53±3.45高劑量組High dose group4周 4 weeks1.52±0.362.48±0.341.42±0.8212.08±2.978周 8 weeks1.43±0.382.17±0.943.27±0.57?13.12±4.5912周 12 weeks1.23±0.28?1.98±0.802.29±0.44?11.50±5.20

注：*P< 0.05，與對照組相比有統(tǒng)計學意義。

Note： *P< 0.05, compared with the control group, statistically significant.

表3 草甘膦對睪酮合成相關(guān)蛋白表達的影響Table 3 Effects of glyphosate on testosterone synthesis related proteins n=10)

注：*P< 0.05，與對照組相比有統(tǒng)計學意義。

Note： *P< 0.05, compared with the control group, statistically significant.

2.3 草甘膦對大鼠性激素水平的影響

析因設(shè)計方差分析結(jié)果表明草甘膦暴露劑量對T表達水平有顯著影響(P<0.01)，對FSH表達水平也有影響(P<0.05)，時間對T含量有顯著影響(P<0.01)，對FSH影響不顯著(P>0.05)，劑量與時間間沒有交互作用(P>0.05)。單因素方差分析表明大鼠血清中FSH和T水平隨染毒劑量和時間增加呈下降趨勢，染毒第8周和第12周時高劑量組T水平明顯低于對照組(P<0.05)，染毒12周時高劑量組FSH水平明顯低于對照組(P<0.05)，染毒組LH和E2水平與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，結(jié)果見表2。

2.4 草甘膦對睪酮合成相關(guān)蛋白的影響

睪酮合成的反應(yīng)底物為膽固醇，膽固醇被轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)膜時才能啟動睪酮合成途徑，這個過程受許多蛋白和酶的控制。免疫組化實驗顯示隨染毒劑量增加，中、高劑量組StAR和P450scc蛋白表達水平逐漸下降(P<0.05)，17β-HSD和3β-HSD蛋白表達水平未見顯著改變，實驗結(jié)果見圖2、圖3和表3。

3 討論(Discussion)

T合成和分泌的主要場所是睪丸間質(zhì)細胞，T合成和分泌的量取決于細胞的數(shù)量和單個細胞合成T的能力。病理學結(jié)果可見草甘膦高劑量組睪丸生精小管、生精細胞、間質(zhì)結(jié)構(gòu)均有不同程度損害，其中間質(zhì)細胞的損壞會影響T合成和分泌，導致大鼠合成T能力下降。染毒后大鼠睪丸臟體比增大，與病理組織學觀察到的睪丸組織水腫結(jié)果一致。

性激素具有促進性器官成熟、副性征發(fā)育及維持性功能等作用，常見的性激素有LH、FSH、PRL(泌乳素)、PROG(孕酮)、E2、T。T能促進男性生殖器官發(fā)育，維持男性性功能及第二性征，并且與FSH共同作用于睪丸曲細精管，促進精子的發(fā)生和成熟。下丘腦-垂體-性腺軸可控制血清中T水平，下丘腦主要通過釋放GnRH刺激FSH和LH的釋放。FSH作用的靶細胞是支持細胞，可促進雄激素結(jié)合蛋白(ABP)的產(chǎn)生；LH能刺激睪丸間質(zhì)細胞合成和釋放T，并與睪丸間質(zhì)細胞膜上LH受體(LHR)結(jié)合，促進睪酮合成酶體系的磷酸化，加速T合成[13]。LH與FSH共同作用，促進精子生成。本實驗大鼠血清中FSH和T水平呈下降趨勢，表明草甘膦能干擾FSH合成和分泌，影響雄性激素的合成，導致T水平的降低。

T合成原料是膽固醇，膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運至內(nèi)膜的跨膜轉(zhuǎn)運是T合成的限速步驟[14]。StAR(類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白)是一種膽固醇的轉(zhuǎn)運蛋白，在T合成過程中起到非常重要的作用[15]。StAR進入線粒體后快速成熟，使得線粒體內(nèi)外兩層膜之間形成接觸電位，幫助膽固醇進入線粒體[16-17]。本實驗結(jié)果顯示隨染毒劑量增加，StAR表達水平明顯下降，導致膽固醇從線粒體外膜到內(nèi)膜的跨膜轉(zhuǎn)運受到阻礙和限制，影響T合成。P450scc是細胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶，膽固醇在P450scc催化作用下合成孕烯醇酮，孕烯醇酮是重要的合成T的前體物質(zhì)[18]。P450scc受到抑制，會影響膽固醇在線粒體內(nèi)形成孕烯醇酮的過程，導致孕烯醇酮含量減少[19-20]。即使StAR將膽固醇大量地轉(zhuǎn)運到線粒體內(nèi)，但由于P450scc水平下降，也會使T合成降低[21]。本實驗結(jié)果顯示P450scc表達水平隨染毒劑量增加逐漸下降，使孕烯醇酮合成降低，導致T合成量減少。孕烯醇酮在3β-HSD(3β-羥基類固醇脫氫酶)等酶的作用下生成雄烯二酮，再經(jīng)17β-HSD(17β-羥基類固醇脫氫酶)和其他酶的作用下生成T[22]。本實驗結(jié)果顯示染毒組中3β-HSD和17β-HSD表達水平與對照組沒有顯著差異，說明草甘膦不能通過影響3β-HSD和17β-HSD表達水平改變T合成。

總之，草甘膦一方面通過降低FSH水平，影響T合成和分泌；另一方面通過降低T合成的相關(guān)蛋白StAR和P450scc表達水平，影響膽固醇轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)的含量和膽固醇生成孕烯醇酮的過程，導致T合成障礙，二者共同作用導致草甘膦染毒后機體T水平的降低，產(chǎn)生雄性生殖毒性作用。