馬 琳，姚 婷，任向峰，談太聰，張亮然，王友升,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學，北京 100048；2.山東大學 微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東 青島 266237）

柿（Diospyros kaki）屬柿樹科落葉喬木，適應性強，是我國各地廣泛栽培的一種果樹，也是我國原產(chǎn)著名漿果，華北為主要產(chǎn)區(qū)[1]。研究表明，柿子不僅營養(yǎng)豐富，而且具有抗動脈硬化、預防心血管疾病、抗腫瘤、抗老化等作用[2]。但目前柿子加工利用率低，加工種類少，柿果在儲藏以及運輸過程中極易軟化[3]，又因存在褐變這一難題，造成柿子價值無法真正被利用[4]。柿子果酒的加工不僅解決了柿子儲藏的問題，而且具有很高的保健價值和營養(yǎng)價值[5]。而釀酒酵母是影響果酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素，也是影響果酒口感和風味的重要因素，篩選適合釀造柿子果酒的優(yōu)良菌株尤為重要。曹衛(wèi)華[6]研究了固定化酵母發(fā)酵柿子果酒的營養(yǎng)成分，結(jié)果顯示柿子果酒中含有大量的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等。但對于釀酒酵母特性影響柿子果酒品質(zhì)鮮見報道。

影響釀酒酵母發(fā)酵能力的生物學特性包括對糖的利用能力以及對酸、滲透壓、SO2和乙醇的耐受力[7]。這些特性的調(diào)控機制主要通過環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）信號通路產(chǎn)生影響[8]，cAMP和cGMP是具有在細胞內(nèi)進行信息傳遞作用的第2信使，能夠?qū)庑盘杺鲗е良毎恕－h(huán)核苷酸磷酸二酯酶（cyclic nucleotide phosphodiesterase，PDEs）是cAMP和cGMP信號通路的關(guān)鍵酶，具有水解細胞內(nèi)第2信使cAMP或cGMP的功能，從而終止第2信使所傳導的生化作用[9]。PDEs超家族可分I型和II型兩大類[10]，酵母中含有兩種PDE（PDE1和PDE2），這兩種PDE在細胞內(nèi)的定位及功能有顯著差別[11-12]。PDE1屬于II型超家族，在對cAMP/cGMP信號通路調(diào)控釀酒酵母生活力的研究中，PDE1具有cAMP和cGMP的雙底物催化活性且對兩種底物的催化活性差別不大。PDE2屬于I型超家族，PDE2基因的過量表達可提高酵母對氧化脅迫和乙醇的耐受性[13-14]。PDE1和PDE2都可水解cAMP，PDE2對cAMP的親和力（Km=0.17～1 μmol/L）[15-16]遠高于PDE1（Km=100～150 μmol/L）[17-18]。胡蕓[12]研究了釀酒酵母高親和力cAMP磷酸二酯酶PDE2蛋白的胞內(nèi)定位及表達調(diào)節(jié)，結(jié)果表明蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）對PDE2的定位和蛋白水平有重要的調(diào)節(jié)作用；Ma Pingsheng等[19]研究發(fā)現(xiàn)PDE1在控制葡萄糖和細胞內(nèi)酸化誘導的cAMP信號傳導中有特定作用，通過將絲氨酸252誘變?yōu)楸彼嵯贫ǖ腜KA磷酸化位點導致PDE1（Ala252）等位基因顯然具有降低的體內(nèi)活性。但國內(nèi)外鮮見有關(guān)PDEs基因缺失菌株對柿子果酒發(fā)酵產(chǎn)生影響的報道。

本研究利用野生型釀酒酵母以及PDEs基因缺失菌株對磨盤柿進行發(fā)酵釀酒，通過比較發(fā)酵期間磨盤柿果酒的理化指標、抗氧化能力、活性物質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)的變化，比較PDE1和PDE2基因缺失菌株與野生型釀酒酵母發(fā)酵特性的差異，比較不同突變體之間發(fā)酵特性的差異，從而判定PDE1和PDE2基因?qū)δケP柿果酒發(fā)酵的影響，為篩選優(yōu)良發(fā)酵菌種奠定基礎(chǔ)，為進一步構(gòu)建新的用于果酒發(fā)酵的PDE1和PDE2基因缺失釀酒酵母提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

磨盤柿（Diospyros kaki ‘Mopan’）采于北京市房山區(qū)磨盤柿產(chǎn)區(qū)。

野生型釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為本實驗室保存菌株。PDE1基因單拷貝敲除菌株P(guān)DE1/Δpde1，PDE2基因單拷貝敲除菌株P(guān)DE2/Δpde2，PDE1基因雙拷貝敲除菌株Δpde1/Δpde1，PDE2基因雙拷貝敲除菌株Δpde2/Δpde2。突變菌株構(gòu)建：結(jié)合同源重組原理[20]和醋酸鋰酵母高效轉(zhuǎn)化實驗[21]進行基因敲除。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

YPD培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加水補足1 L，121 ℃滅菌15 min。YPD液體培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加水補足1 L，121 ℃滅菌15 min。

DNA分子質(zhì)量標準2×Taq PCR MasterMix、Marker VII、6×Loading Buffer（溴酚藍） 天根生化試劑公司；潮霉素B、G418 SULFATE、Triton-x100、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris methyl aminomethane，Tris）、乙二胺四乙酸鈉（sodium ethylene diamine tetracetate，EDTA）美國Amersco公司；脫氧核糖核酸鈉鹽、乙酸鋰、聚乙二醇 美國Sigma-Alorich公司；三氯甲烷、乙醇、鹽酸（均為分析純） 北京化工廠；引物由Invitrogen公司負責合成。

1.2 儀器與設(shè)備

HQ45恒溫搖床 武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司；5810R高速離心機、微量移液器 美國Effendorf公司；生物安全柜 美國Thermo公司；4 ℃預冷離心機 美國Sigma公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；Imager 2200凝膠成像系統(tǒng)美國ALpha公司；QP2010 GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀日本島津公司；手動固相微萃取進樣器 美國Supelco公司；PC-420D固相微萃取工作臺、75 μm CAR/PDMS萃取頭 美國Corning公司；PHS-3D pH計 上海三信儀表廠；PR-201數(shù)字式糖度計 上海右一儀器有限公司；Molecular Devices SpectraMax 190酶標儀 上海艾研生物科技有限公司；T6-新世紀分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造工藝

工藝流程：原料篩選→脫澀處理→破碎→成分調(diào)節(jié)→接種→初發(fā)酵→過濾→陳釀→再過濾→成品。

工藝要點：采摘的新鮮磨盤柿進行脫澀處理并除梗后充分破碎；攪拌混勻后分裝，每3 kg置于5 L玻璃罐中，25 ℃發(fā)酵，并進行3 次重復實驗。發(fā)酵前期（玻璃瓶底部出現(xiàn)少量氣泡上升）、中期（磨盤柿皮渣形成“冒”蓋在玻璃瓶頂部）、后期（液面無明顯氣泡上升，皮渣下沉至底部）攪拌均勻后取樣，取樣時間點設(shè)為0、3、9、12 d。

1.3.2 發(fā)酵特性測定

1.3.2.1 理化指標

可溶性固形物（soluble solids content，SSC）：采用數(shù)字式糖度儀測定其SSC。總糖：利用苯酚-硫酸法[22]測定。乙醇體積分數(shù)：采用酒精計測定。pH值：采用酸度計測定。以上測定各重復3 次。

1.3.2.2 活性物質(zhì)

總酚：參考Singleton等[23]方法。以沒食子酸作標準曲線，醪液中總酚含量換算為每克樣品中沒食子酸的含量?？傸S酮：總黃酮含量的測定參照Jia Zhishen等[24]的方法進行并加以改進。以蘆丁作標準曲線，醪液中總酚含量換算為每克樣品中蘆丁的含量。

1.3.2.3 抗氧化能力測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定參考Blois等[25]的方法進行；2’-聯(lián)氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical，ABTS）自由基清除能力測定參照Mariken等[26]的方法進行；總還原力測定參考Liyana-Pathirana等[27]的方法。以上指標均以標準品Trolox當量表示。

1.3.2.4 揮發(fā)性物質(zhì)

稱取3.0 g樣品置于15 mL固相微萃取專用樣品瓶中，隔膜封口，將75 μm CAR/PDMS萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜儀250 ℃的進樣口老化1 h后，迅速拔出插入樣品瓶（避免接觸底部樣品），隨后置于60 ℃磁力攪拌器加熱平衡20 min后進行氣味吸附30 min，最后取出萃取頭迅速插入進樣口，250 ℃解吸6 min進行風味檢測。

氣相色譜條件：SPB-50柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；手動無分流進樣，進樣口溫度250 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min速率升溫至150 ℃，再以15 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min；檢測器溫度250 ℃，載氣為氦氣，恒流流速1 mL/min，溶劑切除時間1 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度220 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～600 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標結(jié)果

圖1 接種野生型和突變菌株磨盤柿發(fā)酵醪液的品質(zhì)變化Fig. 1 Changes in quality attributes during Mopan persimmon wine fermentated by wild-type and mutant strains

從圖1可以看出，野生型釀酒酵母以及PDEs基因缺失菌株在發(fā)酵過程中SSC、總糖、pH值、乙醇體積分數(shù)的變化趨勢大體一致。接種前，磨盤柿醪液的SSC為22.5 °Brix，總糖質(zhì)量分數(shù)為44%，pH 6.0。PDEs基因缺失菌株均能加快對糖的利用速率，其中Δpde2/Δpde2菌株釀造的磨盤柿酒中SSC以及總糖含量下降速率最快，在發(fā)酵結(jié)束后SSC為8.8 °Brix，總糖質(zhì)量分數(shù)為0.86%，分別為野生型的66%和21%；Δpde1/Δpde1菌株利用糖的效率最低，發(fā)酵結(jié)束后總糖質(zhì)量分數(shù)為1.72%，為野生型的43%；PDE1/Δpde1菌株、PDE2/Δpde2菌株發(fā)酵結(jié)束后總糖含量分別是野生型的35%和38%。Δpde2/Δpde2菌株在發(fā)酵前9 d乙醇體積分數(shù)增加速率最快，Δpde1/Δpde1菌株增加速率最慢，與利用糖的效率呈正相關(guān)。

以上結(jié)果表明，PDEs基因缺失菌株均會提高磨盤柿果酒發(fā)酵速率，其中Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵速率最快，而Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵速率最慢。cAMP和cGMP是細胞內(nèi)信號傳遞的第2信使，而PDEs具有水解第2信使的功能，有研究表明，釀酒酵母中主要由PDE2調(diào)控胞內(nèi)cAMP水平[28]，而且Wilson等[29]研究得出PDE2編碼磷酸二酯酶的作用可能是幫助將內(nèi)部cAMP與外部環(huán)境隔離，因此敲除PDEs基因后會加速信號傳遞，從而提高釀酒酵母對糖的利用速率。Ma Pingsheng[19]和Wilson[30]等均提出，PDE1對控制葡萄糖和細胞內(nèi)酸化反應起著重要的生理作用，由此推斷，敲除PDE2基因可能會增強釀酒酵母中PDE1基因?qū)ζ咸烟堑目刂?，從而提高釀酒酵母對糖的利用效率。所以用Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵的磨盤柿果酒發(fā)酵速率最快。

2.2 活性物質(zhì)分析結(jié)果

圖2 接種野生型和突變菌株磨盤柿發(fā)酵醪液活性物質(zhì)含量Fig. 2 Changes in total phenol and total fl avonoid contents during persimmon wine fermentation by wild-type and mutant strains

從圖2可以看出，PDEs基因缺失菌株發(fā)酵的磨盤柿果酒總酚與總黃酮含量與野生型相比差異較大。接種前，磨盤柿醪液的總酚質(zhì)量濃度為0.33 mg/mL，總黃酮質(zhì)量濃度為0.52 mg/mL。PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2菌株隨發(fā)酵時間延長總酚含量降低；野生型在前3 d下降最快，在3～9 d有所上升然后趨于平緩；Δpde1/Δpde1菌株在發(fā)酵前9 d總酚含量一直降低，9～12 d明顯上升；Δpde2/Δpde2菌株先降低后上升再降低。到達發(fā)酵終點時，野生型發(fā)酵的磨盤柿果酒的總酚質(zhì)量濃度為0.19 mg/mL，PDE1/Δpde1和Δpde1/Δpde1菌株的總酚含量均高于野生型，分別為野生型的1.4 倍和1.3 倍，而PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株的總酚含量分別為野生型的73%和68%。

PDEs基因缺失菌株與野生型在發(fā)酵0～3 d時總黃酮含量都下降，野生型菌株持續(xù)下降到第9天后又緩慢上升；PDE1/Δpde1菌株在3～9 d上升而9～12 d下降；Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株在3～12 d緩慢上升；PDE2/Δpde2菌株平緩下降。到達發(fā)酵終點時，野生型發(fā)酵的磨盤柿果酒總黃酮質(zhì)量濃度為0.44 mg/mL，4 株突變體的總黃酮含量均高于野生型，依次分別是野生型的1.22、1.5、1.1 倍和1.2 倍。

以上結(jié)果表明，接種野生型與突變株釀酒酵母的磨盤柿醪液發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)含量總體呈下降趨勢，與郭敏等[31]結(jié)果一致。與野生型釀酒酵母相比，PDE1/Δpde1和Δpde1/Δpde1菌株會提高磨盤柿果酒的總酚含量，而PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株會降低磨盤柿果酒的總酚含量；釀酒酵母PDEs基因缺失會提高磨盤柿果酒中總黃酮含量，且Δpde1/Δpde1菌株釀造的磨盤柿果酒中總黃酮含量最高。有研究顯示，在釀酒酵母中2 種磷酸二酯酶在酸性條件下調(diào)節(jié)細胞活力中發(fā)揮不同作用，PDE1基因是酸性條件下細胞活力的負調(diào)節(jié)劑，PDE2基因是酸性條件下細胞活力的正調(diào)節(jié)劑[32]，由此推斷，當敲除PDE1基因后，釀酒酵母的細胞活力增強，從而合成總酚總黃酮的能力相對較強，因此Δpde1/Δpde1菌株釀造的磨盤柿果酒中總酚總黃酮含量較高，且PDE1雙敲比單敲合成總酚總黃酮的能力強。

2.3 抗氧化能力分析結(jié)果

圖3 接種不同釀酒酵母磨盤柿發(fā)酵醪液抗氧化能力指標Fig. 3 Changes in antioxidant properties during persimmon wine fermentation by wild-type and mutant strains

由圖3可知，接種前，磨盤柿醪液的ABTS自由基清除能力為42 μg/g，DPPH自由基清除能力為97 μg/g，總還原力為90 μg/g。野生型發(fā)酵醪液中ABTS自由基清除能力隨發(fā)酵時間延長而緩慢減小，到達9 d后趨于平緩；4 株突變體的清除能力在0～9 d緩慢增強，到達9 d減小并趨于平緩。發(fā)酵結(jié)束后，野生型菌株釀造的磨盤柿果酒對于ABTS自由基清除能力為35.83 μg/g，PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株的清除能力均比野生型強，分別是野生型的1.37、1.21、1.64 倍和1.5 倍。

所有菌株對于DPPH自由基清除能力總體均隨發(fā)酵時間延長而上升最后趨于平緩，到達發(fā)酵終點時，野生型菌株DPPH自由基清除能力為155.74 μg/g，PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株的清除能力均比野生型強，分別是野生型的1.14、1.08、1.25 倍和1.65 倍。

不同菌株釀造的磨盤柿果酒總還原力隨發(fā)酵時間延長的趨勢不同，發(fā)酵終點時，野生型菌株釀造的磨盤柿果酒總還原力為130.41 μg/g，Δpde2/Δpde2菌株的總還原力最強，為野生型的1.06 倍，PDE1/Δpde1和Δpde1/Δpde1菌株的還原力均低于野生型，分別為野生型的92%和70%，PDE2/Δpde2菌株的總還原力為129.81 μg/g，與野生型接近。

以上結(jié)果表明，與野生型釀酒酵母相比，PDEs基因缺失菌株會提高磨盤柿果酒對ABTS自由基以及DPPH自由基的清除能力，Δpde2/Δpde2菌株會提高磨盤柿果酒的總還原力。綜合比較，PDE2基因缺失菌株比PDE1基因缺失菌株抗氧化能力強，且Δpde2/Δpde2菌株的抗氧化能力最強。有研究指出，PDE2缺失會影響許多不同功能類別的基因[33]，由此推測用PDE2基因缺失菌株釀造磨盤柿果酒表現(xiàn)出更高的抗氧化活性。

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果

磨盤柿破碎后的果汁與在發(fā)酵12 d時野生型與突變株釀酒酵母發(fā)酵的磨盤柿果酒經(jīng)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析后得揮發(fā)性成分相對含量對比結(jié)果見表1。經(jīng)物質(zhì)匹配度篩選共檢測出31 種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要為醇類6 種，酯類12 種，烷烴類8 種，酸類2 種，其他化合物共3 種。

表1 接種野生型和突變菌株的磨盤柿果酒主要香氣成分Table 1 Analysis of aroma components in Mopan persimmon wine fermented by wild-type and mutant strains

由表1可知，經(jīng)野生型釀酒酵母發(fā)酵得到的磨盤柿果酒的主要揮發(fā)性成分有乙醇、二甲基硅烷二醇、異戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、2-氧代十八烷酸甲酯、棕櫚酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、二十烷、二十一烷、二十四烷、二十八烷、二十九烷、三十二烷、三十六烷、四十烷、乙縮醛、苯乙烯、蒽共25 種香氣物質(zhì)，其中乙醇、乙酸乙酯、二十九烷、三十二烷、四十烷的含量在果酒中含量較高。

PDEs基因缺失菌株與野生型釀酒酵母釀造的磨盤柿果酒中的風味物質(zhì)種類差異不大，但含量差異較為明顯。PDE1/Δpde1菌株的揮發(fā)性物質(zhì)只比野生型多乙酸異戊酯；Δpde1/Δpde1菌株比野生型多山梨醇、乙酸異戊酯、L-乳酸這3 種物質(zhì)；PDE2/Δpde2菌株釀造的磨盤柿果酒中，未檢測出二甲基硅烷二醇，但檢測出了正己酸乙酯、順式-4-癸烯酸乙酯；Δpde2/Δpde2菌株釀造的果酒中未檢測出三十二烷，檢測出了正己酸乙酯。劉曉艷等[34]對磨盤柿果酒中的香氣成分進行了氣相色譜-質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)異戊醇和苯乙醇等是磨盤柿酒的主要香氣成分。且苯乙醇具有玫瑰香味和蜜香，香味獨特，是構(gòu)成磨盤柿酒主要特征香氣的組分，乙酸乙酯被認為是對果酒總體香氣貢獻最強的化合物[35]，辛酸乙酯具有玫瑰花香和橙子果香[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，Δpde2/Δpde2菌株釀造的磨盤柿果酒中醇類相對含量為43.46%，其中異戊醇相對含量為3.46%，苯乙醇為1.93%，均比野生型高，且PDE2/Δpde2型的酯類相對含量為25.24%，是野生型的1.66 倍，可以推斷出其風味最佳。但揮發(fā)性物質(zhì)的代謝過程非常復雜，對于上述風味及底物是否轉(zhuǎn)變成有益物質(zhì)及其機理和安全性，尤其果實本身風味的轉(zhuǎn)化還是釀酒酵母內(nèi)的代謝過程，還需要進一步探討。

3 結(jié) 論

本實驗結(jié)合同源重組原理和基因敲除技術(shù)，得到PDE1和PDE2基因單敲和雙敲菌株的釀酒酵母突變菌株，并在相同條件下比較4 株突變體與野生型釀酒酵母對磨盤柿果酒發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，PDEs基因缺失菌株發(fā)酵特性優(yōu)于野生型菌株，4 株突變體菌株均會提高磨盤柿果酒發(fā)酵速率，其中Δpde2/Δpde2菌株在發(fā)酵過程中糖的消耗速率以及乙醇體積分數(shù)的上升速率最快；接種PDEs基因缺失菌株以及野生型菌株的磨盤柿果酒總酚、總黃酮含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)下降趨勢；抗氧化能力在發(fā)酵前期上升明顯，后期趨于平穩(wěn)，其中接種Δpde2/Δpde2菌株的磨盤柿果酒活性物質(zhì)與抗氧化能力相對較高。PDEs基因缺失菌株與野生型釀酒酵母釀造的磨盤柿果酒中的風味物質(zhì)種類差異不大，PDE2/Δpde2菌株釀造的磨盤柿果酒中酯類相對含量較高，產(chǎn)香能力較強，風味最佳。