徐 核，譚艾娟，呂世明

(貴州大學(xué)：1.藥學(xué)院微生物與生化藥學(xué)系;2.生命科學(xué)學(xué)院;3動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)，可能使人類重新面臨感染性疾病的威脅?！岸糁萍?xì)菌耐藥”已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大課題[1]。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制有很多,其中，耐藥基因通過轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)在不同細(xì)菌間形成水平轉(zhuǎn)移最為重要[2]。因此，如果能抑制細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合，即能抑制細(xì)菌耐藥基因的轉(zhuǎn)移，就可能抑制耐藥菌或多重耐藥菌的形成，為解決目前面臨的嚴(yán)峻細(xì)菌耐藥問題尋找到一種新的有效途徑和方法[3]。為此本研究旨在以肺炎鏈球菌(streptococcus pneumonia,SP)標(biāo)準(zhǔn)菌株作為受體菌，以青霉素耐藥SP(penecillin resistant SP，PRSP)的DNA作為外源性DNA，以脫氧核糖核酸酶(deoxyribonucleases，DNase)作為抑制劑[4]，通過轉(zhuǎn)化和抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，探討DNase在SP轉(zhuǎn)化過程中抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用，以便為探究DNase抑制PRSP和其他相關(guān)耐藥菌的形成提供前期研究，為開發(fā)阻斷耐藥基因水平傳播的新型藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 (1)菌株來源：BNCC338425 SP標(biāo)準(zhǔn)菌株購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。臨床分離的PRSP最低抑菌濃度[(MIC)≥2 μg/mL]，由重慶醫(yī)科大學(xué)北碚附屬醫(yī)院惠贈(zèng)。(2)主要儀器與試劑：微量移液器購自上海求精生化試劑儀器有限公司。超凈工作臺購自蘇州安泰空氣凈化有限公司。SZ-9Z自動(dòng)三重純水蒸餾器購自上海亞榮生化儀器廠。LDZX-30FBS立式高壓滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠。SH2-82A恒溫振蕩器(搖床)購自常州澳華儀器有限公司。高速臺式離心機(jī)(TGL-161)購自上海安亭科學(xué)儀器廠。電熱恒溫水槽(DK-8D)購自上海一恒科技有限公司。NanoPhotometer超微量核酸測定儀購自德國的Implen公司。電熱恒溫箱購自上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。FA2004電子天平購自上海精科天平廠。腦心浸液肉湯(BHI培養(yǎng)基)購自貴州鼎國生物技術(shù)有限公司。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司。苯唑西林藥敏紙片購自貴陽宏碩生物科技有限公司。Optochin藥敏紙片購自上海金穂生物科技有限公司。DNase Ⅰ購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1提取PRSP的DNA并進(jìn)行相關(guān)鑒定 用微量移液器將PRSP保種液200 μL分別加入含1 mL BHI培養(yǎng)基的離心管中，置于37 ℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)13 h(大約為SP生長曲線平臺期的后期)，然后將每管少量的細(xì)菌培養(yǎng)液在校正為0.5麥?zhǔn)媳葷岫群笸坑谘桨迳喜⒃谄鋬?nèi)貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進(jìn)行SP的培養(yǎng)、生化鑒定和青霉素藥敏試驗(yàn)，同時(shí)將每管內(nèi)的細(xì)菌培養(yǎng)液用煮沸法提取DNA以致每管獲得大約70 μL的DNA提取液,并檢測DNA溶液的濃度和純度。將DNA提取液儲存于-20 ℃冰箱內(nèi)以備用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和DNase抑制實(shí)驗(yàn)。

1.2.2用外源性PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株并進(jìn)行相關(guān)鑒定 將消毒處理后的SP標(biāo)準(zhǔn)菌株的凍干管移入超凈工作臺內(nèi)，將0.3 mL無菌水注入凍干管中并吹打以便使凍干菌粉充分溶解成菌懸液，將菌懸液接種至血平板上，置于37 ℃及5%CO2的電熱恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。待血平板上的菌懸液培養(yǎng)36 h并生長出典型成熟的SP菌落后，依次挑取SP標(biāo)準(zhǔn)菌株的單菌落分別放入含1 mL BHI培養(yǎng)基的20個(gè)離心管中，然后將這些離心管隨機(jī)分成10個(gè)實(shí)驗(yàn)組和10個(gè)對照組并置于37 ℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入感受態(tài)時(shí)才能易于捕獲外源性DNA繼而發(fā)生轉(zhuǎn)化，而SP的感受態(tài)出現(xiàn)在對數(shù)生長期的后期，依據(jù)SP生長曲線在振蕩培養(yǎng)6 h后才開始進(jìn)入對數(shù)生長期后期，待振蕩培養(yǎng)6 h適時(shí)地向?qū)嶒?yàn)組的每個(gè)離心管內(nèi)加入濃度為(87.3±47.3)μg/μL PRSP的DNA提取液140 μL，同時(shí)向?qū)φ战M的每個(gè)離心管內(nèi)加入濃度為0.9%的鹽水140 μL[5]。當(dāng)細(xì)菌群體的生長繁殖處于對數(shù)期和穩(wěn)定期交匯點(diǎn)時(shí)，液體培養(yǎng)基內(nèi)的被轉(zhuǎn)化和未被轉(zhuǎn)化的活細(xì)菌數(shù)已達(dá)到頂峰并且細(xì)菌轉(zhuǎn)化窗口已經(jīng)關(guān)閉(SP感受態(tài)持續(xù)約40 min)[5]，依據(jù)SP生長曲線這個(gè)交匯點(diǎn)大約為9 h，當(dāng)振蕩培養(yǎng)9 h實(shí)驗(yàn)組和對照組同時(shí)結(jié)束培養(yǎng)[6]。然后取實(shí)驗(yàn)組和對照組的每管少量細(xì)菌培養(yǎng)液在校正為0.5麥?zhǔn)媳葷岫群笸坑谘桨迳喜⒃谄鋬?nèi)貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進(jìn)行SP的培養(yǎng)、生化鑒定和青霉素藥敏試驗(yàn)。

1.2.3DNase抑制PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株并進(jìn)行相關(guān)鑒定 SP標(biāo)準(zhǔn)菌株的凍干菌粉復(fù)活培養(yǎng)與以上相關(guān)操作相同，實(shí)驗(yàn)組和對照組的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)基、培養(yǎng)的最初菌落數(shù)、培養(yǎng)的隨機(jī)分組及其他培養(yǎng)條件亦與以上相關(guān)內(nèi)容相同。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組和對照組在搖床內(nèi)培養(yǎng)6 h時(shí)，向?qū)嶒?yàn)組的每個(gè)培養(yǎng)管中加入PRSP的DNA溶液140 μL和濃度為18.75 U/μL的DNase溶液100 μL〈溶劑為生理鹽水〉，以及分別向?qū)φ战M的每個(gè)培養(yǎng)管中加入PRSP的DNA溶液140 μL。當(dāng)振蕩培養(yǎng)9 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對照組結(jié)束培養(yǎng)。然后取實(shí)驗(yàn)組和對照組的每管少量細(xì)菌培養(yǎng)液在校正為0.5麥?zhǔn)媳葷岫群笸坑谘桨迳喜⒃谄鋬?nèi)貼上Optochin和苯唑西林藥敏紙片進(jìn)行SP的培養(yǎng)、生化鑒定和青霉素藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1提取PRSP的DNA及相關(guān)鑒定結(jié)果 在PRSP保種液活化培養(yǎng)后，各培養(yǎng)管細(xì)菌的Optochin試驗(yàn)均顯示陽性，即Optochin紙片的抑菌環(huán)直徑均大于14 mm；苯唑西林藥敏試驗(yàn)顯示各培養(yǎng)管細(xì)菌對青霉素不敏感，即苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑均小于或等于19 mm；從各培養(yǎng)管的細(xì)菌懸液中均提取到DNA，即每管DNA提取液的體積約70 μL并且濃度為(87.3±47.3)μg/μL。

2.2PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株及相關(guān)鑒定結(jié)果 在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)菌的Optochin紙片抑菌環(huán)直徑均大于14 mm，Optochin試驗(yàn)均顯示陽性；在實(shí)驗(yàn)組的苯唑西林藥敏試驗(yàn)中在每個(gè)抑菌圈外均有一個(gè)明顯的由低到高直至正常菌落密度的銅錢狀的抑菌環(huán)帶，而在對照組的苯唑西林藥敏試驗(yàn)中在每個(gè)抑菌圈外無此特征性的抑菌環(huán)帶；實(shí)驗(yàn)組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑為(23.3±2.2)mm，對照組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑為(33.5±3.0)mm，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.74，P<0.01)。原始結(jié)果見圖1。

2.3DNase抑制PRSP的DNA轉(zhuǎn)化SP標(biāo)準(zhǔn)菌株及相關(guān)鑒定結(jié)果 在抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)菌的Optochin紙片抑菌環(huán)直徑均大于14 mm，Optochin試驗(yàn)均顯示陽性；在對照組的苯唑西林藥敏試驗(yàn)中在每個(gè)抑菌圈外均有一個(gè)明顯的由低到高直至正常菌落密度的銅錢狀的抑菌環(huán)帶，而在實(shí)驗(yàn)組的苯唑西林藥敏試驗(yàn)中抑菌圈外的抑菌環(huán)帶與對照組相比減弱；實(shí)驗(yàn)組、對照組苯唑西林藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑分別為(29.6±4.7)、(17.6±9.4)mm，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.60，P<0.05)。原始結(jié)果見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后對照組和實(shí)驗(yàn)組的Optochin試驗(yàn)和青霉素藥敏試驗(yàn)圖片

圖2 抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后對照組和實(shí)驗(yàn)組的Optochin試驗(yàn)和青霉素藥敏試驗(yàn)圖片

3 討 論

由于廣譜抗菌藥的濫用及細(xì)菌間耐藥基因的轉(zhuǎn)移，細(xì)菌對常用抗菌藥物耐藥的發(fā)展已成為人類健康事業(yè)面臨的嚴(yán)重問題之一[7]。因此，合理應(yīng)用抗菌藥物是其主要的應(yīng)對措施，而開發(fā)的新型抗菌藥物不能隨時(shí)滿足臨床耐藥菌感染治療的需求[1]，阻斷細(xì)菌間耐藥基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)和藥物也很匱乏，以致使細(xì)菌耐藥危機(jī)日趨嚴(yán)峻[8]。鑒于細(xì)菌間耐藥基因的水平傳播是當(dāng)今細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因，探尋切斷細(xì)菌間耐藥基因水平傳播的新技術(shù)和新藥物將是破解細(xì)菌耐藥危機(jī)的重要途徑之一。為此，本研究以SP標(biāo)準(zhǔn)菌株作為受體菌，以PRSP的DNA作為外源性DNA，以DNase作為抑制劑，通過轉(zhuǎn)化和抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，探討DNase在SP轉(zhuǎn)化過程中抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用，為開發(fā)阻斷耐藥基因水平傳播的新型藥物提供新思路。

本研究在提取DNA實(shí)驗(yàn)階段，獲取了含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA提取液。在對PRSP菌株(MIC≥2 μg/mL)培養(yǎng)后，培養(yǎng)后的細(xì)菌Optochin試驗(yàn)顯示陽性和青霉素藥敏試驗(yàn)顯示不敏感，說明PRSP菌株在培養(yǎng)過程中未被雜菌污染，培養(yǎng)后的細(xì)菌仍然是PRSP。用煮沸法從培養(yǎng)后的細(xì)菌懸液提取DNA后，DNA提取液的檢測結(jié)果顯示從各培養(yǎng)管的細(xì)菌懸液中均提取到DNA，表明每管均提取了PRSP的DNA。而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SP臨床菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性與pbp2b、pbp2x和pbp1a基因突變密切相關(guān)[9]，其中pbp2x基因突變可介導(dǎo)pbp2b、pbp1a等其他pbps基因突變，pbp2b基因突變導(dǎo)致低水平青霉素耐藥，pbp2b和pbp1a基因突變導(dǎo)致高水平青霉素耐藥[10]。結(jié)合以上研究，表明本研究從PRSP中提取的DNA應(yīng)該含有pbp2b、pbp2x和pbp1a突變基因，符合本研究轉(zhuǎn)化需要的含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA。

本研究在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)階段，用含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA提取液，使SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感的菌株。依據(jù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后的Optochin試驗(yàn)陽性結(jié)果，可判斷在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)組和對照組的SP均未受到雜菌污染；基于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后的苯唑西林藥敏試驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組抑菌環(huán)直徑小于對照組(P<0.01)，可判斷實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌獲得了青霉素低敏感的性狀；根據(jù)對照組的對等、同步和專設(shè)的作用[11-12]，判定實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌獲得的青霉素低敏感的性狀不是由非處理因素引起，而是由含SP青霉素耐藥基因的外源性DNA引起[5]；根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道可知，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌獲得的青霉素低敏感的性狀是SP標(biāo)準(zhǔn)菌株攝入了SP青霉素耐藥基因并成功地重組和表達(dá)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)組的特征性抑菌環(huán)帶也間接地支持上述分子機(jī)制，因?yàn)橹挥胁煌腟P標(biāo)準(zhǔn)菌在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)過程中攝入不同種類的青霉素耐藥基因并成功地重組和表達(dá)，使SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為多種青霉素低敏感菌株，才能在抑菌圈外出現(xiàn)銅錢狀的抑菌環(huán)帶。

本研究在抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)階段，用DNase抑制了SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感菌株，顯示DNase具有抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用。基于抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后的Optochin試驗(yàn)陽性結(jié)果，可推斷在抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)組和對照組的SP均未受到雜菌污染。依據(jù)抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后的苯唑西林藥敏試驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組抑菌環(huán)直徑大于對照組(P<0.05)，可推斷DNase抑制了SP標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感菌株。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組的抑菌環(huán)帶與對照組相比減弱，也可支持DNase抑制了SP標(biāo)準(zhǔn)菌轉(zhuǎn)化為青霉素低敏感菌株。由于生物大分子DNase不易進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，不可能作用于外源性基因的重組和表達(dá)，很可能作用于外源性基因的轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)，因而DNase的分子抑制機(jī)制既有DNase隨機(jī)剪切外源性SP青霉素耐藥基因以顯示抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，又有DNase特異切割SP青霉素耐藥基因調(diào)控序列以顯現(xiàn)抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的功能[13-15]。

總之，DNase具有抑制SP青霉素耐藥基因轉(zhuǎn)移的作用，是依次通過外源性DNA提取實(shí)驗(yàn)、SP的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和SP的抑制轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)而揭示。本研究結(jié)果表明，DNase具有阻抑PRSP形成的潛在功能；同時(shí)，還表明DNase具有阻抑一些其他耐藥菌形成的潛在作用。本研究結(jié)果將為深入研究DNase阻抑耐藥細(xì)菌形成和開發(fā)阻斷耐藥基因水平傳播的藥物提供前期研究及思路。