王 冰，黃靖香，盧世璧，彭 江

1首都醫(yī)科大學(xué)密云教學(xué)醫(yī)院，北京 101500；2解放軍總醫(yī)院 骨科研究所/北京市再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100853

許多疾病可使膀胱喪失功能，如癌癥、創(chuàng)傷、先天性疾病等，臨床常采取腸代膀胱等手術(shù)治療方法，但存在感染、梗阻、黏液分泌、電解質(zhì)紊亂、穿孔等問題。早在1994年，Cilento等完成了體外泌尿系移行上皮細(xì)胞的大規(guī)模擴(kuò)增，至此揭開了組織工程膀胱研究的序幕[1]。隨著組織工程技術(shù)的進(jìn)步，出現(xiàn)了組織工程尿道[2]、膀胱[3]等在泌尿外科領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。組織工程技術(shù)包含支架材料、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子。天然膀胱細(xì)胞外基質(zhì)(bladder accellular matrix，BAM)是較好的支架材料，含有的膠原和彈性纖維等利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)研究采用化學(xué)脫細(xì)胞法制備的豬膀胱細(xì)胞外基質(zhì)作為支架材料，復(fù)合人臍帶WJ-MSCs，探索二者之間的相容性，為組織工程膀胱的研究探索新的種子細(xì)胞。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 選取巴馬香豬6只，購(gòu)自解放軍醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，體質(zhì)量15 kg左右，雄性。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；PBS緩沖液(Hyclone公司，美國(guó))；0.05%胰酶(Gibco，US)；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國(guó))；青/鏈霉素(雙抗)混合液(Gibco，美國(guó))；MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(北京方潤(rùn)生物公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(美國(guó)Sigma公司)。

2 豬膀胱細(xì)胞外基質(zhì)(PBAM)的制備及鑒定 取實(shí)驗(yàn)用香豬的新鮮膀胱6枚置于無(wú)菌瓶中(圖1A)，去除周圍脂肪、筋膜等組織。對(duì)照組：無(wú)菌PBS反復(fù)洗滌后取1 cm×1 cm膀胱組織做冷凍切片，并行HE、甲苯胺藍(lán)和Hoechst33258染色。實(shí)驗(yàn)組：將預(yù)儲(chǔ)存-20℃冰箱內(nèi)的膀胱置于氧化還原酸化水中，漂洗3次，隨后置于-20℃低滲凍存。然后將其浸泡于3%過氧化氫溶液中，置搖床，直至變白。加入1% SDS溶液(pH=9)，置搖床，定時(shí)換液。重新置入6% Triton X-100(pH=9)，置搖床至膀胱呈白色(圖1B)。取脫細(xì)胞后的膀胱組織(1 cm×1 cm)做冰凍切片，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，同法行三種染色后觀察。將PBAM行冷凍干燥機(jī)凍干后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

3 透鏡及掃描電鏡觀察PBAM 以掃描電鏡(Hitachi S-4800)觀察PBAM結(jié)構(gòu)，以無(wú)水乙醇法測(cè)孔隙率，每塊PBAM測(cè)試3次，然后取平均值。

4 人臍帶WJ-MSCs的分離、培養(yǎng)及成脂、成骨誘導(dǎo) 人臍帶由解放軍總醫(yī)院產(chǎn)科提供，已征得產(chǎn)婦及家屬書面同意。實(shí)驗(yàn)完全符合國(guó)務(wù)院頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定[4]。將臍帶以75%乙醇消毒(圖2A)，0.9%氯化鈉注射液洗滌后剪成3段，完整剔除臍帶內(nèi)2根動(dòng)脈和1根靜脈(圖2B)。將Wharton膠撕下置入培養(yǎng)皿中反復(fù)洗滌，再移入錐形瓶后離心6 min(1 700 r/min)，離心后棄去洗滌液。Wharton膠中加入DMEM培養(yǎng)液，將Wharton膠剪成1 ～ 4 mm3微小組織勻漿塊。加入DMEM培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)皿，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以1∶2比例傳代。取P3代人臍帶WJ-MSCs分別按照成脂、成骨相應(yīng)方法進(jìn)行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)完成后采用油紅O、茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察。

5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按國(guó)家生物材料評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)制備PBAM浸提液，實(shí)驗(yàn)組將包含10% FBS的25%、50%和100%濃度的PBAM浸提液培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照組以DMEM培養(yǎng)細(xì)胞。將密度為1.5×105/ml的人臍帶WJ-MSCs接種于96孔板上，分別與25%、50%和100%濃度的浸提液和對(duì)照組DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。將第1天的孔內(nèi)加入MTT溶液培養(yǎng)4 h，加入DMSO溶液，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm條件下測(cè)定吸光度(A)值。第2 ～ 6天同樣處理并測(cè)定，最后記錄并繪制增殖曲線。另外，取將1×106/ml密度的人臍帶WJ-MSCs懸液接種于6孔板內(nèi)的PBAM表面，共9孔為實(shí)驗(yàn)組；以相同細(xì)胞密度懸液?jiǎn)渭兘臃N于6孔板內(nèi)，共9孔為對(duì)照組，全部置入培養(yǎng)箱中，第3、5、7天取材，每次每組各取3個(gè)孔，以酶消化法收集細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行比較。

6 細(xì)胞-支架復(fù)合物的相容性觀察 PBAM的6孔板接種1×106/ml密度的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)后分別于第5、7、9天取材，冷凍切片后行Hoechst33258及AO染色，于熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)將第5天的細(xì)胞-支架復(fù)合物以10%戊二醛固定，行掃描電鏡(SEM)觀察WJ-MSCs在PBAM上的生長(zhǎng)情況。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。全部數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 PBAM制備 A:新鮮豬膀胱外觀; B:脫細(xì)胞膀胱; C:凍干的PBAMFig. 1 PBAM preparation A: appearance of fresh porcine bladder; B: acellular bladder; C: lyophilized PBAM

圖2 人臍帶Wharton膠A：人臍帶外觀，B：Wharton膠, 2根動(dòng)脈和1根靜脈Fig. 2 Human umbilical cord Wharton glue A: appearance of human umbilical cord; B: Wharton glue, two arteries and one vein

圖3 兩組分別進(jìn)行3種染色，對(duì)照組見明顯細(xì)胞核排列，而實(shí)驗(yàn)組則未見細(xì)胞殘留Fig. 3 The two groups were stained with three kinds of dyeing. The nucleus of the control group was obviously arranged, but there was no cell residue in the experimental group

結(jié) 果

1 PBAM的觀察及鑒定 HE染色：實(shí)驗(yàn)組可見大量淡粉色的膠原纖維，未見被藍(lán)染的細(xì)胞核，對(duì)照組可見大片排列整齊被藍(lán)染的細(xì)胞核。甲苯胺藍(lán)染色：實(shí)驗(yàn)組未見被藍(lán)染的細(xì)胞核，可顯示膀胱組織富含堿性黏多糖，對(duì)照組可見大片被藍(lán)染的細(xì)胞核。Hoechst33258染色：實(shí)驗(yàn)組未見被藍(lán)染的細(xì)胞核殘留，對(duì)照組可見排列整齊、分布均勻且被藍(lán)染的細(xì)胞核(圖3)。

2 透鏡及掃描電鏡觀察(SEM)PBAM 光鏡下可見PBAM為多孔材料，孔隙致密，孔隙間交互貫通(圖4A)。SEM掃描可見PBAM外層表面大小不一的孔隙，內(nèi)側(cè)面可見較多褶皺，粗糙不平(圖4B)。經(jīng)無(wú)水乙醇法檢測(cè)PBAM的孔隙率約為93%。

3 人臍帶WJ-MSCs形態(tài)觀察 Wharton膠組織塊培養(yǎng)4 d后可見干細(xì)胞爬出較多，第6天可見大量呈魚群狀細(xì)胞排列生長(zhǎng)，高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)略呈三角狀或成纖維狀，細(xì)胞體積大且細(xì)胞核不規(guī)則，核仁明顯，排列緊密(圖5)。

圖4 PBAM形態(tài)A：透鏡下的PBAM，可見較多孔隙，以及相互貫通； B：SEM下呈大小不同的多個(gè)孔隙(×1 000)Fig. 4 PBAM under the perspective electron microscopy and SEM A: pores and interpenetration can be seen； B: multiple pores with different sizes (×1 000)

圖5 WJ-MSCs形態(tài) A：培養(yǎng)4 d后干細(xì)胞從組織塊內(nèi)爬出(×100)； B：WJ-MSCs呈多邊形或三角形(×100)； C：培養(yǎng)6 d后呈魚群樣生長(zhǎng)(×100)Fig. 5 WJ-MSCs morphology A: at 4 days after culture, stem cells crawled out of the tissue block (x 100); B: WJ-MSCs showed polygon or triangle shape (×100); C: fibroblast-like growth (×100) at 6 days after culture

圖6 人臍帶WJ-MSCs成脂、成骨誘導(dǎo)A：成脂誘導(dǎo)油紅“O”染色，可見大量的脂滴形成(×100)； B：成骨誘導(dǎo)茜素紅染色，可見許多鈣化點(diǎn)，以及高倍鏡下的黑色鈣結(jié)節(jié)(×100)Fig. 6 WJ-MSCs adipogenic and osteogenic induction A: oil red staining for adipogenic induction (×100); B: alizarin red staining for osteogenic induction(×100)

圖7 不同濃度PBAM浸提液對(duì)人臍帶WJMSCs增殖的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of PBAM extracts on the proliferation of human umbilical cord WJ-MSCs

4 人臍帶WJ-MSCs的成脂、成骨分化誘導(dǎo)結(jié)果及鑒定 P3代人臍帶WJ-MSCs成脂誘導(dǎo)后行油紅O染色，鏡下見WJ-MSCs堆積形成脂滴(圖6A)；而成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后行茜素紅染色，鏡下見許多散在鈣化點(diǎn)，高倍鏡下可見黑色鈣結(jié)節(jié)(圖6B)。

5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 不同濃度浸提液組與DMEM組的吸光度(A)值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同濃度浸提液與DMEM對(duì)人臍帶WJ-MSCs的增殖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖7)。將1×106/ml密度的人臍帶WJ-MSCs培養(yǎng)至第3、5、7天，以酶消化法收集3個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示兩組細(xì)胞的增殖高峰均在培養(yǎng)的第5天，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增加率高于對(duì)照組(P＜0.05)(見表1)。

6 細(xì)胞-支架復(fù)合物活性觀察 復(fù)合物培養(yǎng)至第5天后，行Hoechst33258染色見PBAM上有大量黏附生長(zhǎng)的WJ-MSCs，且細(xì)胞核呈藍(lán)染(圖8A)，AO染色提示PBAM上可見大量活細(xì)胞(圖8B)。掃描電鏡觀察第5天的細(xì)胞-支架復(fù)合物，在PBAM的表面可見大量迭連排列的WJ-MSCs，孔隙間也有大量WJ-MSCs黏附、生長(zhǎng)，分布于PBAM表面，細(xì)胞周邊發(fā)出偽足樣突起黏附PBAM上 (圖 8C，圖 8D)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)Tab. 1 Cell count in experimental group and control group(×105)

討 論

近些年，隨著組織工程皮膚的產(chǎn)業(yè)化，以及組織工程膀胱和尿道的臨床應(yīng)用，人臍帶WJMSCs在疾病的治療和損傷組織修復(fù)中發(fā)揮了巨大作用[5]。張玉石等[6]采用化學(xué)去細(xì)胞法制備了PBAM，按不同比例部分修補(bǔ)了犬膀胱缺損，結(jié)果證實(shí)化學(xué)法制備的PBAM具有較好的生物安全性。本研究制備的PBAM經(jīng)化學(xué)脫細(xì)胞處理后，行3種染色提示脫細(xì)胞效果滿意，且該方法保留利于種子細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的成分。Farhat等[7]對(duì)PBAM進(jìn)行了研究顯示其存留有Ⅰ、Ⅲ型纖維膠原蛋白，而且彈性蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白僅略有減少，其余肌動(dòng)蛋白、肌凝蛋白和波形蛋白等仍存在，PBAM仍維持其機(jī)械特性。本研究通過掃描電鏡可見外層表面大小不一的孔隙，內(nèi)側(cè)面可見較多褶皺，粗糙不平，測(cè)定其孔隙率為93%，適合種子細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)。

間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增和分化是隨著細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境的外部信號(hào)和微環(huán)境的改變而變化的。本研究從人臍帶Wharton膠中分離培養(yǎng)出的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)觀察和生物學(xué)特性的鑒定，成功誘導(dǎo)其進(jìn)行多向分化，如成骨、脂肪細(xì)胞等，與研究報(bào)道結(jié)果一致[8-10]。田洪榛等[11]研究發(fā)現(xiàn)18個(gè)月內(nèi)經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植WJ-MSCs可改善缺血性心衰患者左心室功能，24個(gè)月時(shí)仍提高了患者活動(dòng)耐量及生活質(zhì)量，且安全有效。Yuan等[12]收集第1 ～ 5代膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清，配制成條件培養(yǎng)液成功誘導(dǎo)WJ-MSCs定向分化為膀胱平滑肌細(xì)胞。人臍帶WJ-MSCs來源于醫(yī)療廢棄的人臍帶，易獲得，常規(guī)培養(yǎng)即可，且具有間充質(zhì)干細(xì)胞的生物特性，是較好的干細(xì)胞治療及種子細(xì)胞的選擇，也被用來進(jìn)行臨床疾病的治療[13]。

圖8 細(xì)胞-支架復(fù)合物 A：培養(yǎng)第5天后行Hoechst33258染色(×100)，可見大量被藍(lán)染的細(xì)胞核，且排列整齊； B：AO染色(×100)，PBAM表面有大量活細(xì)胞，呈亮紅色； C：培養(yǎng)第5天的SEM結(jié)果(×1 000)，可見PBAM表面黏附有大量人臍帶WJ-MSCs； D為局部放大2 000倍，可見伸出多個(gè)類似偽足樣突起黏附于PBAM表面Fig. 8 Cell-Scaffold complex A: at the 5 days after culture, Hoechst33258 staining (×100) showed a large number of blue stained nuclei and they arranged orderly; B:AO staining (×100)showed a large number of living cells on the surface of PBAM with bright red color, C: at the 5 days after culture (×1 000), a large number of human umbilical WJ-MSCs adhered to PBAM surface, D for local amplification of 2 000 times, showed a number of pseudo foot like projections were sticking to the surface of PBAM.

Chen等[14]將豬內(nèi)皮祖細(xì)胞與BAMG復(fù)合，同時(shí)外源性給予血管生成因子(VEGF)后發(fā)現(xiàn)，VEGF可以提高結(jié)合內(nèi)皮祖細(xì)胞的BAMG的新血管形成，可作為增加組織工程膀胱血供的適宜途徑。而且Hsieh等[15]研究發(fā)現(xiàn)人臍帶WJ-MSCs比骨髓MSC更具血管再生能力，以及對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用。高紅亮和易發(fā)現(xiàn)[16]研究發(fā)現(xiàn)利用大鼠膀胱無(wú)細(xì)胞基質(zhì)負(fù)載大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外成功構(gòu)建組織工程膀胱復(fù)合物。王瓊等[17]膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)-絲素蛋白雙層支架經(jīng)皮下預(yù)制處理后，修復(fù)大鼠膀胱擴(kuò)大術(shù)后膀胱缺損的效果滿意。本實(shí)驗(yàn)采用人臍帶WJ-MSCs作為種子細(xì)胞復(fù)合PBAM支架材料，PBAM浸提液對(duì)細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組DMEM培養(yǎng)液無(wú)明顯差異(P＞0.05)，說明化學(xué)法制備的PBAM無(wú)細(xì)胞毒性，且可促細(xì)胞增殖。目前由于PBAM的制備還無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，而其生物安全性的相關(guān)檢測(cè)還需進(jìn)一步完善。Li等[18]證實(shí)人臍帶WJ-MSCs能夠表達(dá)前列腺特異性抗原，表明其在泌尿系統(tǒng)中的應(yīng)用潛能。本實(shí)驗(yàn)觀察到人臍帶WJ-MSCs進(jìn)入PBAM孔隙內(nèi)，且很快變形為多邊形，伸出類似偽足黏附于PBAM上，自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)也促進(jìn)其黏附、增殖及分化，成功制備了細(xì)胞-支架復(fù)合物補(bǔ)片。該實(shí)驗(yàn)為后期體內(nèi)試驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)，也為組織工程膀胱的研究提供了新的種子細(xì)胞。