肖 秧，王 佳，關(guān) 偉，楊二娜,2，王茂全，陳國(guó)鳳，周 薇，張 娟,2，呂 娜,2，李永輝，王智鼎,2，王立新，于 力,2

1解放軍總醫(yī)院 血液科，北京 100853；2深圳大學(xué)總醫(yī)院，廣州深圳 518055；3解放軍海軍總醫(yī)院，北京 100048

地西他濱(decitabine，DAC)是一種去甲基化藥物，2006年4月和5月地西他濱由歐洲EMEA和美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，主要用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性骨髓增生異常綜合征。地西他濱可通過(guò)抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase)達(dá)到DNA低甲基化，從而誘導(dǎo)表達(dá)沉默的甲基化基因重新表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞的凋亡[1-2]。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，且患者5年生存率僅為40%左右[3]。證據(jù)表明DNA甲基化異常是AML發(fā)生的一個(gè)重要分子機(jī)制。近年來(lái)地西他濱應(yīng)用于AML的臨床治療并取得了肯定的療效，為白血病的治療提供了新的方法[4]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，小劑量地西他濱可促進(jìn)小鼠淋巴瘤/白血病細(xì)胞EL4凋亡并抑制EL4細(xì)胞增殖，可通過(guò)DNA去甲基化機(jī)制上調(diào)EL4細(xì)胞表面CD80表達(dá)，在體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答[5]。本研究繼續(xù)探討地西他濱對(duì)于小鼠急性粒-單核白血病細(xì)胞WEHI-3是否具有相似的作用并探索其機(jī)制。

材料和方法

1 試劑與儀器 小鼠急性粒-單核白血病細(xì)胞WEHI-3(購(gòu)于美國(guó)模式菌種收集中心，American Type Culture Collection，ATCC)。 地 西 他 濱， 西安楊森公司生產(chǎn)，規(guī)格50 mg，批號(hào)CIBS601。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS和雙抗溶液(含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)購(gòu)自Hyclone公司；PBS、25%胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自Solarbio公司。CK-2熒光倒置顯微鏡(Olympus)、流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur)。脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、隨機(jī)引物(Random Primer)、莫羅尼鼠類(lèi)白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶 (Moloney murine leukemia virus，MMLV)、RNA酶抑制物(RNase inhibitor)、5倍鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶溶液(5×MMLV RT Buffer)、無(wú)核酶水(RNasefree water)均購(gòu)自Promega。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 采用DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)基(90% DMEDM+10%小牛血清+1%雙抗)與37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)WEHI-3細(xì)胞。

3 瑞氏吉姆薩染色 將經(jīng)高壓消毒的蓋玻片鋪在六孔板底層，在六孔板內(nèi)兩孔中加入1×106WEHI-3細(xì)胞，采用DAC(終濃度0.25μmol/L)和PBS連續(xù)處理3 d，停藥24 h后吸去細(xì)胞液，取出蓋玻片。在蓋玻片的細(xì)胞上滴6滴瑞氏吉姆薩染液和8滴緩沖液，染色3 min后清水沖洗，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(Olympus)觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用地西他濱(0.25μmol/L)分別處理WEHI-3細(xì)胞 24 h、48 h、72 h，PBS處理組采用等體積PBS處理72 h。停藥24 h后收集細(xì)胞，常溫4 500 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗兩次，加入400μl的1×binding buffer重懸細(xì)胞，加入AnnexinV和PI各2μl混勻后室溫放置15 min，轉(zhuǎn)移至流式管內(nèi)1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 用地西他濱(0.25μmol/L)處理WEHI-3細(xì)胞24 h，并以PBS處理24 h為對(duì)照。停藥24 h后收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄盡上清，PBS洗滌兩次，加入30%甲醛，室溫固定15 min。最后用PBS清洗后用1×binding buffer 100μl重懸細(xì)胞，加入PI 2μmol/L，混勻后避光孵育15 min后轉(zhuǎn)移至流式管中上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

6 逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 按照逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成；按照SYBRGreen試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。所用引物由生工生物工程(上海)公司合成。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。MMD mRNA前引物序列：5'-CAGCTAATGGCCGCTACAAAC-3'，后引物序列5'-CAGCAGTCATCAGACAGCCG-3'；CITED2 mRNA前引物序列5'-CGCCAGGTTTAACAACTCCCA-3'，后引物序列5'-TGCTGGTTTGTCCCGTTCAT-3'；TAF7L mRNA前引物序列5'-AGCCCCCGTTATTCC TGAAG-3'后引物序列5'-CCTCGGGTGTCACAAGT GT-3'；TSG101 mRNA前引物序列5'-TCTAACCGT CCGTCAAACTGT-3'，后引物5'-TTGTACCAGTGA GGTTCACCA-3'；內(nèi)參基因GAPDH mRNA引物序列5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGA-3'，后引物5'-TCTTGGGCTACACTGAGGAC-3'。采用 2-△△CT比較mRNA的相對(duì)表達(dá)含量。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)變化 PBS處理后的WEHI-3細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、呈圓形，大小比較均一，核質(zhì)比大(圖1A)；地西他濱處理后的WEHI-3細(xì)胞體積明顯增大，胞質(zhì)增多，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)濃縮，邊緣化 (圖 1B)。

2 地西他濱對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 PBS對(duì)照處理的WEHI-3細(xì)胞，形狀規(guī)則，呈圓形，大小均一。而地西他濱處理24 h后WEHI-3細(xì)胞開(kāi)始變大，形狀比較不規(guī)則，出現(xiàn)呈長(zhǎng)條形的細(xì)胞；地西他濱處理48 h后WEHI-3細(xì)胞變得更大，大小不均一，形態(tài)不規(guī)則；地西他濱處理72 h后WEHI-3細(xì)胞透亮度明顯下降，細(xì)胞明顯變大，數(shù)目明顯減少(圖2A)。地西他濱處理24 h、48 h的WEHI-3細(xì)胞，與用PBS對(duì)照處理的WEHI-3細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯的早期凋亡和晚期凋亡；而用地西他濱處理72 h的WEHI-3細(xì)胞則有15.8%的早期凋亡和11.0%的晚期凋亡(圖2B)。

3 地西他濱對(duì)細(xì)胞周期的影響 PBS對(duì)照處理的WEHI-3細(xì)胞G1期占39.64%，S期占49.43%，G2期占8.74%(圖3A)。地西他濱處理的WEHI-3細(xì)胞G1期占78.02%，S期占15.86%，G2期占2.91%(圖3B)?？梢?jiàn)地西他濱處理后，處在G1期的細(xì)胞明顯增加，處在S期與G2期的細(xì)胞明顯減少。說(shuō)明地西他濱處理后WEHI-3的細(xì)胞周期被阻滯。

4 地西他濱處理前后WEHI-3細(xì)胞中MMD、TAF7L、TSG101、CITED2 mRNA表達(dá)水平 經(jīng)過(guò)地西他濱處理后MMD、TAF7L、TSG101、CITED2 mRNA表達(dá)明顯高于PBS對(duì)照組(P＜0.01)。見(jiàn)圖4。

圖1 地西他濱處理前后瑞氏吉姆薩染色下形態(tài)變化(×100)Fig. 1 Effect of decitabine on morphological changes under Wright's Giemsa staining (×100)

圖2 地西他濱不同作用時(shí)間對(duì)WEHI-3細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞凋亡的影響Fig. 2 Effect of decitabine on WEHI-3 cells' morphological change and apoptosis at different time points

圖3 PBS和地西他濱對(duì)WEHI-3細(xì)胞周期的影響A：PBS處理的WEHI-3細(xì)胞周期；B：地西他濱處理的WEHI-3細(xì)胞周期Fig. 3 Effect of PBS and decitabine on cell cycle of WEHI-3 A: Cell cycle distribution of WEHI-3 cells treated with PBS control; B: Cell cycle distribution of WEHI-3 cells treated with decitabine

圖4 PBS對(duì)照組和地西他濱組的MMD，TAF7L，TSG101，CITED2 mRNA表達(dá)水平Fig. 4 MMD, TAF7L, TSG101, CITED2 mRNA expression levels in PBS control group and decitabine group

討 論

表觀遺傳是指非基因DNA序列改變而引起的基因表達(dá)水平的變化，其中DNA甲基化是目前研究最多的一種表觀遺傳學(xué)修飾方式。其主要發(fā)生在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上，異常的CpG甲基化能夠引起基因組不穩(wěn)定從而表達(dá)異常分子，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。故而去甲基化藥物地西他濱通過(guò)去甲基化可以達(dá)到抗腫瘤的作用。臨床上，地西他濱在治療MDS和髓系白血病均取得了較好的效果[6]，此外其還可上調(diào)腫瘤細(xì)胞上癌睪丸抗原和主要組織相容性復(fù)合物[7-8]的表達(dá)，與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。雖然地西他濱治療急性髓系白血病的治療效果明確，但具體機(jī)制仍需研究。

TSG101于1996年在鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是一個(gè)具有多功能結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)泛素介導(dǎo)的蛋白降解。TSG101能夠?qū)?xì)胞的細(xì)胞周期、增殖以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響[9-10]。有研究表明TSG101在胃癌、乳腺癌等腫瘤侵襲發(fā)展以及化療多重耐藥中起到了重要的作用。在血液腫瘤中，有研究者發(fā)現(xiàn)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤分泌的細(xì)胞外囊泡中大量分泌TSG101，可能在彌漫大B淋巴瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了相關(guān)作用[11]。MMD基因在巨噬細(xì)胞中被鑒定為與從單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化相關(guān)的基因，研究已經(jīng)證明巨噬細(xì)胞的活化促進(jìn)了癌癥的轉(zhuǎn)移[12]。在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的研究中發(fā)現(xiàn)MMD基因是NSCLC患者復(fù)發(fā)和存活的重要標(biāo)志[13]。有研究表明與良性肺組織相比，肺癌中MMD的蛋白水平增加，并且敲低MMD基因后體外體內(nèi)抑制可A549和Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)的生長(zhǎng)，可影響肺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖，并可能作為肺癌治療的新分子靶點(diǎn)[14]。TAF7L基因是一種癌睪丸抗原(CTA)[15]。在一項(xiàng)AML患者基因表達(dá)差異程度與性別相關(guān)性的研究中，發(fā)現(xiàn)TAF7L基因在59%的男性AML患者中表達(dá)下調(diào)，提示TAF7L基因可能在AML的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了作用，并可能成為AML免疫治療的靶點(diǎn)[16]。CITED2基因可以調(diào)節(jié)乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP/p300，并且其表達(dá)水平與急性髓性白血病(AML)具有相關(guān)性。有研究表面表明CITED2在腫瘤中與增殖，腫瘤遷移及化療耐藥相關(guān)，并在調(diào)節(jié)p53活性的途徑中發(fā)揮作用，可能成為AML治療的有效靶標(biāo)[17-18]?；贛MD、TSG101、TAF7L、CITED2基因在癌癥的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本研究采用Q-PCR檢測(cè)急性白血病細(xì)胞WEHI-3中經(jīng)地西他濱處理后MMD、TSG101、TAF7L、CITED2 mRNA表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)地西他濱處理后WEHI-3細(xì)胞中MMD、TSG101、TAF7L、CITED2 mRNA表達(dá)水平顯著提高(P＜0.01)，并且小鼠白血病細(xì)胞WEHI-3在經(jīng)小劑量地西他濱處理72 h后，發(fā)生了15.8%的早期凋亡；在地西他濱處理后，處在G1期的細(xì)胞明顯增加，處在S期與G2期的細(xì)胞明顯減少，說(shuō)明其細(xì)胞周期被阻滯。表明小劑量地西他濱可以上調(diào)WEHI-3細(xì) 胞 內(nèi) MMD、TSG101、TAF7L CITED2基因的表達(dá)，從而對(duì)小鼠白血病細(xì)胞WEHI-3的凋亡和細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，有成為AML治療靶點(diǎn)的潛在可能。

綜上，地西他濱在體外可有效抑制小鼠急性粒-單核白血病細(xì)胞WEHI-3生長(zhǎng)，并可能通過(guò)上調(diào)MMD、CITED2、TAF7L、TSG101基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)凋亡產(chǎn)生影響，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期。