胡春風(fēng) 王翠艷 劉紅英（通訊作者）

（濰坊醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室 山東 濰坊 261053）

21-三體綜合征(Trisomy 21syndrome)，又稱唐氏綜合征(Down's syndrome)，是新生兒最常見(jiàn)的非整倍體染色體疾病[1-3]。主要臨床特征是智力低下，特殊面容和多器官發(fā)育遲緩，對(duì)人類(lèi)傷害極大且無(wú)有效的治療方法。因此產(chǎn)前篩查和產(chǎn)期診斷是預(yù)防該疾病的重要手段[4]。目前臨床常用的染色體核型分析需要依賴有創(chuàng)性手段獲取胎兒細(xì)胞，對(duì)母胎均有一定的風(fēng)險(xiǎn)[5]，因此無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

2007年，Lo等[6]發(fā)現(xiàn)21號(hào)染色體上的胎盤(pán)特異性表達(dá)（Placental Specific Expression Gene,PLAC4）基因僅在胎盤(pán)表達(dá)，具有胎兒特異性。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用胎兒游離核酸進(jìn)行21三體綜合征無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了科學(xué)依據(jù)。隨著基因組技術(shù)在產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用方面取得的最新進(jìn)展[9,10]，有研究者提出母體血漿中PLAC4基因mRNA的定量分析將會(huì)有助于胎兒21三體綜合征的診斷[7,8]。

本研究通過(guò)檢測(cè)妊娠婦女和非妊娠婦女外周血中PLAC4基因mRNA表達(dá)水平差異以及計(jì)算分析健康人群PLAC4基因多態(tài)性位點(diǎn)雜合度，來(lái)探討PLAC4基因在21三體綜合征無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的可行性，為其臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年10月—2017年11月在濰坊市人民醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前檢查的7～16周正常單胎妊娠婦女30例為孕婦組，同期進(jìn)行健康查體非妊娠婦女30例為對(duì)照組，均無(wú)內(nèi)外科疾病和吸煙史。簽署知情同意書(shū)后。抽取外周靜脈血5ml，置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝管中，并于低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 外周血PLAC4基因mRNA的表達(dá)水平檢測(cè)

1.2.1.1 全血RNA的提取 常規(guī)提取兩組婦女樣本的總RNA，終產(chǎn)物溶于20μl DEPC-ddH2O中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，將提取的總RNA進(jìn)行標(biāo)記并保存于-80℃冰箱。

1.2.1.2 PLAC4基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 抽取總RNA 10μl，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組PLAC4基因mRNA的表達(dá)水平，PLAC4基因PCR引物和探針序列如下：

PLAC4引物上游為5’-AAATGCAGATTCTCAGGTCCTAGTG-3’，下游為5’-TGCCGATGGTTCCTGGAA-3’；

PLAC4 Taqman探針為5’-CTGCAAGGTATTCCTG-3’。反應(yīng)總體系為25μl，其中cDNA 5μl，2×Premix緩沖液12.5μl，上下游引物各0.2μl，Taqman探針0.2μl。為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陰性對(duì)照組和4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣本都平行做3個(gè)復(fù)孔。

PLAC4基因的PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，93℃變性45s，60℃退火15s。循環(huán)10次，最后93℃變性30s，59℃退火45s，30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 PLAC4基因SNP位點(diǎn)雜合度檢測(cè)

1.2.2.1 外周血基因組DNA的提取 使用DNA抽提試劑盒（中量血液基因組DNA提取試劑盒-離心柱型，北京天根公司）提取基因組DNA。操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度，OD值介于1.8和2.0之間的留用。將提取的基因組DNA進(jìn)行標(biāo)記并冷凍于-80℃冰箱。

1.2.2.2 引物設(shè)計(jì) 查找NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選PLAC4基因上雜合度較高的4個(gè)SNP位點(diǎn)，候選位點(diǎn)為rs8130833，rs9977003，rs4818219和rs59066201。依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上PLAC4基因序列信息，合成引物序列。

1.2.2.3 檢測(cè)SNP位點(diǎn)雜合度 PCR成份組成：10XBuffer 2μl，Template 1μl，Primer F 0.5μl，Primer R 0.5μl，dNTP 0.5μl，TransStart Taq Polymerase 0.2μl，加 ddH2O補(bǔ)至 20μl。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃ 終延伸5min，變性、退火和延伸進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

4個(gè)位點(diǎn)(rs8130833，rs9977003，rs4818219和rs59066201)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為492bp，487bp，576bp和474bp。

PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦酶消化后，去除部分殘留二聚體和雜質(zhì)對(duì)測(cè)序的影響，將樣本送去金唯智公司測(cè)序。

2.結(jié)果

2.1 外周血中PLAC4基因mRNA的表達(dá)水平

兩組婦女外周血PLAC4 mRNA水平比較見(jiàn)表1。孕婦組PLAC4 mRNA表達(dá)水平的最小值為3.221×103copy/ml，最大值為13.657×103copy/ml，中位數(shù)為7.862×103copy/ml，對(duì)照組中均未檢測(cè)到PLAC4 mRNA的存在。兩組比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。因此，PLAC4mRNA可作為21三體綜合征的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。

表1 兩組標(biāo)本PLAC4 mRNA 水平比較

2.2 PLAC4基因SNP位點(diǎn)雜合度分析

PLAC4基因4個(gè)SNP位點(diǎn)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，4個(gè)位點(diǎn)的原始?jí)A基均為A，rs4818219，rs8130833，rs59066201和rs9977003 原始位點(diǎn)A的基因頻率分別為0.7833，0.850，0.700和0.0167，可以計(jì)算得出PLAC4基因上3個(gè)位點(diǎn)（rs4818219，rs8130833和rs59066201）的雜合度較高，分別為0.339，0.255和0.420（表2），可作為本地人群21三體綜合征無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的候選位點(diǎn)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

表2 SNP位點(diǎn)雜合度分析

3.討論

21三體綜合征是最常見(jiàn)的染色體病之一。近年來(lái)，染色體核型分析一直是臨床上21三體綜合征產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[11,12]。由于該方法是使用有創(chuàng)性手段獲取胎兒細(xì)胞，有一定的風(fēng)險(xiǎn)，故不能在孕婦中廣泛開(kāi)展。因此無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷已被大量倡導(dǎo)。近年來(lái)學(xué)者們致力于探討應(yīng)用母血中胎兒游離核酸無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21三體綜合征的可行性。

本研究中，我們分別檢測(cè)了孕婦組和非孕婦對(duì)照組外周血中PLAC4基因mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，孕婦組PLAC4基因mRNA濃度中位數(shù)為7.862×103copy/ml，而非孕婦組中均未檢測(cè)到PLAC4基因mRNA的存在，因此PLAC4基因mRNA在兩組婦女外周血中的表達(dá)水平存在明顯差異，具有妊娠特異性，可視為21三體綜合征產(chǎn)前診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。而且我們利用PCR和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)PLAC4基因上4個(gè)SNP位點(diǎn)的雜合度進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示其中3個(gè)位點(diǎn)，即rs4818219，rs8130833和rs59066201的雜合度高于20%，可作為PLAC4基因21三體綜合征無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的候選位點(diǎn)。

孕婦外周血中胎兒特異性mRNA的發(fā)現(xiàn)為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的研究開(kāi)辟了新的篇章，從母血中尋找母體不表達(dá)的胎兒特異性mRNA，即不存在胎兒有核紅細(xì)胞微量的缺點(diǎn)，又成功避開(kāi)了龐大的母體背景，實(shí)為從母血中無(wú)創(chuàng)性獲取胎兒遺傳物質(zhì)的最佳途徑。