蘇志彩 邵蔚 張芳玲

視網(wǎng)膜組織的損傷性疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜變性、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞在臨床上較為常見(jiàn)。視網(wǎng)膜損傷后,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)障礙,甚至凋亡,視覺(jué)信息的整合和傳遞就會(huì)受到損害,從而導(dǎo)致視力受損[1]。尋找適當(dāng)?shù)乃幬镒钄?、逆轉(zhuǎn)甚至預(yù)防視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡既是治療疾病的關(guān)鍵,又是目前臨床急需解決的問(wèn)題之一。

由于中藥具有靶點(diǎn)多、不良反應(yīng)小、協(xié)同效果好等優(yōu)點(diǎn),學(xué)者們對(duì)于其在視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用方面的研究一直方興未艾。丹參酮ⅡA為中草藥丹參的主要有效成分之一,具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等活性,另外還具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和心血管等方面的作用。Qian等[2]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 可以上調(diào)損傷的體外培養(yǎng)的神經(jīng)元內(nèi) Bcl-xL,進(jìn)而抑制神經(jīng)元凋亡。谷氨酸(Glu)是一種興奮性氨基酸,視網(wǎng)膜損傷過(guò)程中,RGCs的凋亡和Glu的釋放有關(guān),因此抑制Glu活性,尤其是對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型受體的調(diào)節(jié),已經(jīng)是視神經(jīng)保護(hù)的重要措施。有研究表明丹參酮ⅡA預(yù)處理可促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞活化增生,減輕NMDA誘導(dǎo)的腦損傷[3]。因此本實(shí)驗(yàn)采用NMDA誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系RGC-5細(xì)胞凋亡,觀察丹參酮ⅡA對(duì)RGCs的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RGC-5細(xì)胞(ATCC公司)、丹參酮ⅡA (上海源葉生物有限公司)、引物(上海生工生物技術(shù)工程有限公司)。NMDA、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、地卓西平 (MK-801, NMDA受體拮抗劑)、hoechst 33258染料均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將RGC-5細(xì)胞放置于含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中,在5%CO2,37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用0.25%的胰蛋白酶每2～3 d消化傳代1次。

1.2.2 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率:在96孔培養(yǎng)板內(nèi)種植RGC-5細(xì)胞(1×105/mL),貼壁后將細(xì)胞分為4組:NMDA損傷組、正常對(duì)照組、MK-801陽(yáng)性對(duì)照組、丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組又分為3個(gè)亞組,分別加入0.4μg/mL、4μg/mL、40μg/mL的丹參酮ⅡA;MK-801陽(yáng)性對(duì)照組加入MK-801使其終濃度為10μmol/L;NMDA損傷組和正常對(duì)照組加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板放置于5%CO2,37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h,然后取出細(xì)胞棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍。除正常對(duì)照組以外,其余各組均加入甘氨酸10μmol/L和NMDA 100μmol/L作用30 min,PBS沖洗3遍后恢復(fù)到原來(lái)的培養(yǎng)液環(huán)境。36 h后每孔加入20μL新鮮配置的MTT(5 mg/mL),在波長(zhǎng)490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 Hoechst 染色:按上述方法將培養(yǎng)在蓋玻片上的細(xì)胞分組和處理后(依據(jù)上述MTT結(jié)果,丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組選用4μg/mL 的藥物濃度),用多聚甲醛(4%)固定,PBS沖洗3次,然后加入 hoechst 33258工作液染色5 min,漂洗3遍后封片,用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。熒光顯微鏡下,活細(xì)胞被染成均質(zhì)的藍(lán)色熒光,呈橢圓形,而凋亡的細(xì)胞核呈濃染亮藍(lán)色顆粒塊狀,核固縮。隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)算凋亡百分率(凋亡百分?jǐn)?shù)=凋亡細(xì)胞核數(shù)/細(xì)胞核總數(shù))。

1.2.4 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá):提取4組細(xì)胞總RNA(采用Trizol一步法),逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA,以cDNA為模板(2μL),按照半定量RT-PCR試劑盒提供的步驟進(jìn)行擴(kuò)增。Bcl-2上游引物5′-CTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′,下游引物5′-CCCAGCCTCCGTTATCCT-3′;內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物5′-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′,下游引物5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′;Bax上游引物5′-GCAAACTGGTGCTCAAGGC-3′,下游引物5′-GGGGTCCCGAAGTAGGAGA-3′。擴(kuò)增的Bcl-2、Bax目的片段長(zhǎng)度均為161 bp,內(nèi)參GADPH長(zhǎng)度為520 bp。采用含溴化乙錠的1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物,Kodak凝膠電泳圖像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)RGC-5細(xì)胞活性的影響 與NMDA損傷組相比,MK-801對(duì)照組與丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組中的4μg/mL和40μg/mL亞組細(xì)胞生存率顯著提高(P<0.05),0.4μg/mL丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)亞組的細(xì)胞生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中4μg/mL和40μg/mL亞組間的細(xì)胞生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),因此,選擇4μg/mL的藥物濃度為后續(xù)的有效藥物濃度。見(jiàn)圖1。

注:與NMDA損傷組比較,*P<0.05圖1 各組RGC-5細(xì)胞存活率

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)RGC-5細(xì)胞形態(tài)的影響 正常對(duì)照組RGC-5細(xì)胞呈單層生長(zhǎng),貼壁性好,透光性好,細(xì)胞核較大,有較短的突起,隨著細(xì)胞的生長(zhǎng),突起可以互相連接;NMDA損傷組RGC-5細(xì)胞則皺縮、變圓,透亮度消失,甚至僅剩細(xì)胞碎片;MK-801陽(yáng)性對(duì)照組及丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組RGC-5細(xì)胞仍保持正常細(xì)胞輪廓,皺縮變形,但程度較輕。見(jiàn)圖2。

注:a:正常對(duì)照組;b:NMDA損傷組;c:MK-801陽(yáng)性對(duì)照組;d:丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組圖2 各組RGC-5細(xì)胞的形態(tài)(倒置相差顯微鏡×20)

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)RGC-5細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞,NMDA損傷組的凋亡細(xì)胞百分率為(37.4±0.56)%,而正常對(duì)照組為(3.25±1.12)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組和MK-801陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡百分率分別為(5.9±1.05)%和(6.7±1.43)%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但均明顯低于NMDA損傷組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注:A:正常對(duì)照組;B:NMDA損傷組;C:MK-801陽(yáng)性對(duì)照組;D:丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組圖3 各組Hoechst 染色結(jié)果

2.4 丹參酮ⅡA對(duì)RGC-5細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax 的mRNA水平影響 與正常對(duì)照組相比,NMDA損傷組Bcl-2的mRNA表達(dá)降低(0.27±0.08),Bax的mRNA表達(dá)增加(5.23±0.16),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與NMDA損傷組比較,丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組Bcl-2的mRNA表達(dá)增加(0.84±0.16),Bax的mRNA表達(dá)下降(1.57±0.10),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

RGCs的凋亡是視網(wǎng)膜退行性眼病的共同病理特點(diǎn),可導(dǎo)致視功能不可逆性損害,直至失明。目前普遍認(rèn)為Glu受體遍布視網(wǎng)膜各層,糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病使細(xì)胞外 Glu大量聚集,造成靶細(xì)胞損害,并且主要影響RGCs[4]。眾多證據(jù)表明,Glu大量聚集后激活RGCs細(xì)胞膜上大量的NMDA受體,引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的Ca2+動(dòng)員,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,過(guò)量的Ca2+激活細(xì)胞內(nèi)依賴(lài)Ca2+的信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5]。

RGC-5屬于未分化的幼稚細(xì)胞,除不具有電生理學(xué)特性外,其他生物學(xué)行為和原代培養(yǎng)RGCs基本相似,因此近年來(lái)在實(shí)驗(yàn)研究中廣泛應(yīng)用。該模型克服了RGCs原代培養(yǎng)難分離、培養(yǎng)條件要求高、不能傳代等弊端。Glu作為一種主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在視網(wǎng)膜上發(fā)揮重要作用,NMDA受體是Glu受體的一種亞型,在病理狀態(tài)下,NMDA受體被激活,從而引起RGCs的凋亡,本實(shí)驗(yàn)在體外模擬RGCs損傷后的微環(huán)境,即在體外培養(yǎng)的RGC-5中加入NMDA,成功誘導(dǎo)了RGCs凋亡。

注:A:Bcl-2 mRNA;B:Bax mRNA;Tan ⅡA:丹參酮ⅡA圖4 各組Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

丹參酮ⅡA是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。大量研究表明,丹參酮ⅡA有多種生物學(xué)活性,對(duì)腦神經(jīng)具有保護(hù)作用,如抗氧化、防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡、維持腦內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、保護(hù)血腦屏障等,是潛在的神經(jīng)保護(hù)中藥單體。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA 預(yù)處理可促進(jìn)缺血后星型膠質(zhì)細(xì)胞活化增生,減輕缺血性腦損傷[6]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)丹參酮預(yù)處理可以通過(guò)減少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷起保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[7]。本研究結(jié)果顯示,與NMDA損傷組相比,丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組的RGC-5細(xì)胞損傷明顯減輕,當(dāng)?shù)⑼駻達(dá)4μg/mL的濃度時(shí),RGC-5存活率可有效提高,但濃度增高至40μg/mL時(shí),神經(jīng)元保護(hù)作用反而并沒(méi)有增加,此結(jié)果與劉美琳等[8]的研究結(jié)果基本一致,說(shuō)明丹參酮ⅡA的保護(hù)作用僅在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)性。我們又進(jìn)一步將丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)組和MK-108陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從而進(jìn)一步證實(shí)了丹參酮ⅡA的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)作用。韓若東等[9]研究發(fā)現(xiàn),丹參酮ⅡA對(duì)大鼠早期腦缺血和腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)也顯示丹參酮ⅡA預(yù)保護(hù)后能逆轉(zhuǎn)NMDA處理后引起的Bcl-2 mRNA的表達(dá)下降,Bax的mRNA表達(dá)上調(diào),從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)利用NMDA誘導(dǎo)建立RGCs損傷模型,并證實(shí)丹參酮ⅡA通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2的表達(dá)抑制NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步的體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。