王遠(yuǎn)，凌江紅，2，張麗敏，譚人千，王煜姣，張鈺琴，謝天一，文一惠

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院)

Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICCs)以網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)廣泛分布于人和哺乳動(dòng)物的胃、小腸、結(jié)腸等消化道內(nèi)，主要有推進(jìn)電節(jié)律傳播、轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)、起搏平滑肌活動(dòng)等作用，是調(diào)控胃腸動(dòng)力的重要環(huán)節(jié)。ICCs細(xì)胞內(nèi)有大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、合成后加工、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)及Ca2+儲(chǔ)存動(dòng)態(tài)平衡的重要場(chǎng)所，多種內(nèi)外環(huán)境刺激可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白累積，并引發(fā)一系列后續(xù)反應(yīng)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可抑制細(xì)胞存活和增殖，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬。而ICCs數(shù)量或結(jié)構(gòu)損傷與諸多胃腸動(dòng)力障礙疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，功能性消化不良大鼠胃動(dòng)力障礙與胃竇組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)[2]。ICCs是胃竇組織內(nèi)最主要的細(xì)胞之一，其損傷或數(shù)量異常是胃腸動(dòng)力障礙發(fā)生的關(guān)鍵。枳實(shí)可通過上調(diào)功能性消化不良大鼠ICCs內(nèi)c-kit、SCF的表達(dá)，促進(jìn)ICCs的分化增殖，參與調(diào)節(jié)胃腸活動(dòng)，具有促進(jìn)胃動(dòng)力作用。2017年3～12月，我們基于前期研究的基礎(chǔ)，進(jìn)一步探索枳實(shí)含藥血清對(duì)大鼠胃ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的影響及機(jī)制，為枳實(shí)治療胃腸動(dòng)力障礙性疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠12只，體質(zhì)量(250±10)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK 桂 2015-0003。主要試劑：枳實(shí)飲片購自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房；胎牛血清及Ⅱ型膠原酶(Gibco，USA)；M199培養(yǎng)基(Hyclone，USA)；大鼠干細(xì)胞因子SCF、Ficoll 400密度梯度液、4-PBA(Sigma)；衣霉素(TM)、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、0.25%胰蛋白酶、PBS(Solarbio)；水合氯醛、戊二醛(Kelong)；CD117/c-kit山羊抗大鼠多克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC) -山羊抗兔多克隆抗體(Bioss)；TRIzol(Life)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(TaRaKa)。主要儀器：醫(yī)用超凈工作臺(tái)(Airtech)、CO2培養(yǎng)箱( Thermo Forma)、離心機(jī)(Eppendorf)、正置顯微鏡及倒置相差顯微鏡(Olympus)、透射電鏡(日立)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.2 含藥血清制備 根據(jù)血清藥理學(xué)方法[3，4]制備枳實(shí)含藥血清。取SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半。枳實(shí)按照普通成人(60 kg/人)臨床用量的10倍煎煮藥液，以終濃度105%(1.05 g/mL)對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，每組灌胃量均為1.5 mL/100 g，2次/d，連續(xù)灌服3 d，采血前禁食不禁水12 h，于末次灌服1 h后，用水合氯醛麻醉大鼠，無菌條件下腹主動(dòng)脈采血，采用一次性非抗凝真空采血管收集全血，室溫靜置至血清析出，3 500 r/min離心15 min后分離血清，56 ℃、30 min滅活血清，0.22 μL微孔濾膜過濾除菌，其余放置-80 ℃分裝保存。

1.3 ICCs分離、培養(yǎng) 采用酶解法[5]分離培養(yǎng)大鼠胃竇ICCs。取150 g左右的SPF級(jí)SD大鼠胃竇組織，置于冰上，用4 ℃預(yù)冷PBS沖洗干凈后，剝離胃黏膜和胃肌肉層組織，留取肌間層，加入適量M199培養(yǎng)基，用眼科彎剪快速剪碎肌間層組織為約1 mm×1 mm組織塊，加入二型膠原酶(濃度為1.3 mg/mL)，于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)消化30 min，消化結(jié)束后離心1 200 r/min，共5 min；棄上清，加入M199培養(yǎng)基終止消化，離心1 200 r/min,共5 min；棄上清，再次加入M199培養(yǎng)基勻速吹打300次，過200目篩網(wǎng)去除大塊組織，將過濾后的細(xì)胞懸液收集于離心管內(nèi)，加入等量Ficoll400密度梯度液，1 900 r/min離心15 min，取交界面細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液和25 ng/mL干細(xì)胞因子)重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6～8 h細(xì)胞貼壁后換液，結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2 d換液1次。

1.4 ICCs的免疫熒光鑒定 采用c-kit免疫熒光染色法鑒定ICCs。取原代培養(yǎng)3～5 d的ICCs，用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，加入適量完全培養(yǎng)基后離心(800 r/min，共5 min)，棄上清，再加完全培養(yǎng)基吹打、重懸，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104/mL后接種于含有細(xì)胞爬片的無菌24孔板。經(jīng)穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后，棄掉原有培養(yǎng)基，PBS輕柔沖洗2次，按照以下步驟進(jìn)行c-kit免疫熒光染色：①用4%甲醛固定爬片細(xì)胞，10 min；②PBS沖洗3次，每次3 min，用0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透10 min；③PBS沖洗3次，每次3 min，用5%山羊血清室溫封閉1 h；④將c-kit抗體按1∶100稀釋，置于濕盒內(nèi)與細(xì)胞爬片共孵，4 ℃，過夜；⑤避光，加入FITC標(biāo)記羊抗鼠的IgG(1∶200)室溫孵育1 h；⑥滴加抗猝滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 細(xì)胞分組與干預(yù) 采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑Tm刺激ICCs構(gòu)建ERS模型。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[6，7]提示，予濃度為1 μg/mL的Tm作用于細(xì)胞24 h以誘導(dǎo)細(xì)胞ERS。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ICCs隨機(jī)分為四組：ICCs組加入完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；ERS模型組于完全培養(yǎng)液中加入Tm處理，使Tm終濃度達(dá)到1 μg/mL；抑制劑組于完全培養(yǎng)液中加入終濃度為1 μg/mL TM和10 mmol/L 4-PBA聯(lián)合作用；枳實(shí)組于完全培養(yǎng)液中加入終濃度為1 μg/mL TM和20%枳實(shí)含藥血清聯(lián)合作用。各組加藥后繼續(xù)作用24 h，分別收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)觀察 各組細(xì)胞干預(yù)24 h后，分別收集所有細(xì)胞。各組分別加入2.5%戊二醛，4 ℃固定2 h。PBS浸洗3次，每次5 min。再加入2%四氧化鋨緩沖固定液后固定，4 ℃固定3 h。PBS沖洗3次，每次5 min。用30%-50%-70%-90%-95%-100%乙醇對(duì)樣品進(jìn)行梯度脫水，每步5 min，其中100%乙醇重復(fù)3次。加入丙酮以置換樣品中乙醇，每次10 min，重復(fù)3次；然后將環(huán)氧樹脂與固化劑按以下比例混合并充分?jǐn)嚢柽M(jìn)行滲透：丙酮∶環(huán)氧樹脂=3∶1，室溫作用3 h；丙酮∶環(huán)氧樹脂=1∶1，室溫作用3 h；丙酮∶環(huán)氧樹脂=1∶3，室溫過夜；環(huán)氧樹脂，室溫作用24 h。按2%比例向環(huán)氧樹脂中加入催化劑混勻后進(jìn)行包埋，逐次經(jīng)35 ℃、12 h，45 ℃、12 h，最后60 ℃、24 h烘箱中聚合。超薄切片及常規(guī)電鏡染色。在透射電鏡下觀察各組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)，并采集圖像。

1.7 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。GRP78、ATF6基因序列均從GenBank中獲取。GAPDH正向引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,反向引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；GRP78正向引物：5′-TCAGCCCACCGTAACAATCAAG-3′，反向引物：5′-TCCAGTCAGATCAAATGTACCCAGA-3′；ATF6正向引物：5′-ATCACCTGCTATTACCAGCTACCAC-3′，反向引物：5′-TGACCTGACAGTCAATCTGCATC-3′。TRIzol法提取ICCs細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品RNA純度，A260/A280值為1.8～2.0用于檢測(cè)，按照試劑盒說明書，取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA為模板，GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增GRP78、ATF6基因。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為SYBR Preminx Ex TaqⅡ(2*) 10 μL，引物各0.8 μL，樣本溶液2.0 μL，ROX Reference DyeⅡ(50*) 0.4 μL，加無酶水至20 μL總體積。將配好的PCR反應(yīng)溶液置于7500 Fast Real Time PCR儀上進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 3 s、60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)；生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線，計(jì)算機(jī)分析循環(huán)閾(Ct)值。每個(gè)樣品設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 ICCs光鏡下形態(tài)及免疫熒光鑒定 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ICCs在光鏡下細(xì)胞呈梭形、三角形、星型等，伴有細(xì)長(zhǎng)的分枝狀突起，細(xì)胞質(zhì)較少，胞核大，與周圍細(xì)胞間形成突觸鏈接。倒置熒光顯微鏡下，ICCs免疫熒光鑒定c-kit呈陽性表達(dá)，c-kit是ICCs的特異性標(biāo)記，說明該細(xì)胞即為ICCs。

2.2 ICCs透射電鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài) 正常組ICCs內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)完整、排列整齊； ERS模型組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴(kuò)張、呈囊泡化、相互離散及脫顆粒改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞明顯；抑制劑組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂、呈囊泡化改變；枳實(shí)組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，呈局限性擴(kuò)張。

2.3 各組GRP78、ATF6 mRNA表達(dá)比較 見表1。

表1 各組GRP78、ATF6 mRNA表達(dá)比較(n=6,±s)

注：與空白組相比，*P<0.05；與ERS模型組相比，#P<0.05；與抑制劑組相比，△P<0.05。

3 討論

枳實(shí)味苦、辛、酸，歸脾、胃經(jīng)，具有破氣消積、化痰散痞的功效，對(duì)食積停滯、痞滿脹痛、大便不通等胃腸疾病有較好治療效果[8]。現(xiàn)代研究表明，枳實(shí)及其有效活性成分可參與調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力，改善胃腸道動(dòng)力障礙[9]。胃腸道動(dòng)力障礙的形成原因復(fù)雜，機(jī)制尚未闡明。目前普遍認(rèn)為，ICCs在胃腸動(dòng)力障礙性疾病的發(fā)生及進(jìn)展過程中有重要作用，此與ICCs的生理特性密切相關(guān)，ICCs可起搏并傳播胃腸道慢波電位，參與調(diào)節(jié)胃腸平滑肌的自發(fā)節(jié)律性收縮運(yùn)動(dòng)；且細(xì)胞膜上表達(dá)多種神經(jīng)遞質(zhì)受體，介導(dǎo)胃腸神經(jīng)系統(tǒng)與平滑肌細(xì)胞間的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃腸平滑肌舒縮功能。多種胃腸道動(dòng)力障礙性疾病，如賁門失弛緩癥[10]、糖尿病性胃腸病[11]、慢性假性腸梗阻[12]、慢性傳輸型便秘[13]等，與ICCs網(wǎng)絡(luò)受損、缺失或異常等病理損害密切相關(guān)。因此減輕各種應(yīng)激刺激導(dǎo)致的ICCs細(xì)胞損傷，對(duì)改善消化道動(dòng)力有重要意義。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是細(xì)胞功能正常發(fā)揮的基本條件之一。多種內(nèi)外環(huán)境刺激，如氧化應(yīng)激、炎癥激刺、細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂等均能破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)迅即啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶GRP78被激活，轉(zhuǎn)而結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷增多的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白，因此GRP78的大量表達(dá)被認(rèn)為是發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白持續(xù)增多，超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷時(shí)，可造成細(xì)胞損傷或發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性凋亡，影響細(xì)胞功能的正常發(fā)揮及存活結(jié)局[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用Tm誘導(dǎo)ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，ERS模型組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹、擴(kuò)張、相互離散、囊泡化及脫顆粒等病理形態(tài)改變，且ERS模型組GRP78 mRNA表達(dá)相較于ICCs組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ERS模型成立，ICCs出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性損傷。枳實(shí)組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)輕度腫脹、局限性擴(kuò)張；與ERS模型組相比，枳實(shí)組GRP78 mRNA表達(dá)降低，表明枳實(shí)能緩解ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，減輕ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。

ATF6是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的一個(gè)重要感受蛋白，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78優(yōu)先與錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合并釋放ATF6，進(jìn)而激活其下游信號(hào)分子，參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。活化的ATF6進(jìn)入高爾基體被蛋白酶S1P和S2P剪切，釋放含bZIP結(jié)構(gòu)域的活性轉(zhuǎn)錄因子ATF6(N)進(jìn)入細(xì)胞核，激活GRP78等多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[16]，以應(yīng)對(duì)不良微環(huán)境。已有研究證實(shí)，ATF6通路參與多種疾病的發(fā)生及進(jìn)展過程[17]；且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡，將高表達(dá)的ATF6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞則可使細(xì)胞自噬率和凋亡率顯著增加。由此說明，ATF6高表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的自噬和凋亡。本研究表明，與ICCs組比較，ERS模型組ATF6 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ATF6大量蓄積；與ERS模型組相比，枳實(shí)組ATF6 mRNA表達(dá)降低，表明枳實(shí)能減少ATF6蓄積，有助于修復(fù)ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的ICCs損傷。

綜上所述，枳實(shí)可減輕ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)控ATF6信號(hào)通路有關(guān)。