李艷麗，胡曉麗，韓華，王義舫，付紅霞

(1中國人民解放軍第二六〇醫(yī)院,石家莊050041；2河北省人民醫(yī)院)

乳腺癌為女性常見的惡性腫瘤之一，是發(fā)達國家女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。雖然近年來乳腺癌的預后有所改善，患者5年生存率超過80%，但在手術(shù)治療和全身輔助治療后仍有約30%的患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[2]。微小RNA-214(miR-214)是微小核糖核酸(miRNA)家族成員之一，該基因位于人類染色體1q24.3區(qū)域DNM3 的14 號內(nèi)含子上。miR-214已被證實在多種惡性腫瘤中表達增高或降低，作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生進展[3]。但目前有關(guān)miR-214在乳腺癌中表達的研究甚少，且結(jié)果不一[4，5]。叉頭盒蛋白質(zhì)M1(FOXM1)屬于Forkhead轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員之一，研究已證實其在多數(shù)惡性腫瘤中表達增高，作為促癌基因參與腫瘤進程。近期在對miR-214靶基因的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-214可通過調(diào)控FOXM1進而調(diào)控腫瘤細胞的生物學行為[6]。2018年1～3月，我們檢測了miR-214、FOXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中的表達，分析其相關(guān)性及與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，為進一步研究miR-214和FOXM1在乳腺癌治療中的作用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年1月～2017年1月中國人民解放軍第二六〇醫(yī)院手術(shù)切除的110例乳腺組織新鮮標本，同時收集相應(yīng)的癌旁組織新鮮標本(距離原發(fā)病灶邊緣至少5 cm)作為對照，組織標本在離體后生理鹽水清洗，迅速置入液氮中，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。納入標準：①女性患者；②經(jīng)術(shù)后病理檢查明確為原發(fā)性乳腺癌；③有完整的臨床資料。排除標準：①術(shù)前接受過放化療、生物免疫治療等任何抗腫瘤治療；②合并有其他器官的惡性腫瘤。110例乳腺癌患者中，≥55歲 72例，<55歲38例；絕經(jīng)82例，未絕經(jīng)28例；腫瘤最大直徑≤2 cm 29例，>2 cm 81例；組織學分級Ⅰ級25例，Ⅱ+Ⅲ級85例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期80例，Ⅲ+Ⅳ期30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 乳腺癌及癌旁組織中miR-214、FOXM1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。按照miRNA提取試劑盒或RNA提取試劑盒(北京天根生化公司)說明書提取組織中miRNA或總RNA，分光光度計檢測提取的miRNA或總RNA的純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，采用miR-214或FOXM1特異性逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；40 個循環(huán)(95 ℃ 10 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s)。miR-214正向引物：5′-GCACAGCAGGCACAGAC-3′，反向引物：5′-GCACAGCAGGCACAGAC-3′。U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。FOXM1正向引物：5′-AAGGTTGAGGAGCCTTCGAG-3′，反向引物：5′-ATTCGGTCGTTTCTGCTGCTT-3′。GAPDH正向引物：5′-CGGATTTGGTCGTATTGG-3′，反向引物：5′-TCCTG GAAGATGGTGATG-3′。miR-214以U6作為內(nèi)參基因，F(xiàn)OXM1以GAPDH作為內(nèi)參基因，相對表達采用2-△△Ct法計算。

1.3 乳腺癌及癌旁組織中FOXM1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。提取組織中總蛋白，BCA法定量蛋白質(zhì)濃度。取30 μg/孔 樣品上樣，10% SDS-PAGE電泳分離(60 V 30 min，120 V 50 min)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜(250 mA 90 min)，TBST洗膜3次，室溫下5 %脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入一抗人FOXM1(體積稀釋比例1∶1 000)、GAPDH(體積稀釋比例1∶8 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(體積稀釋比例1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯影液顯影，采集圖片，Quantity One軟件分析條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 miR-214 mRNA在乳腺癌及癌旁組織中的表達比較 乳腺癌組織和癌旁組織中miR-214 mRNA的相對表達量分別為0.40±0.11、1.02±0.06。乳腺癌組織miR-214 mRNA的表達低于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 FOXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌和癌旁組織中的表達比較 乳腺癌和癌旁組織中FOXM1 mRNA的相對表達量分別為4.01±0.45、1.01±0.04，乳腺癌組織中FOXM1 mRNA表達高于癌旁組織(P<0.05)。乳腺癌和癌旁組織中FOXM1蛋白相對表達量分別為0.92±0.23、0.24±0.11，乳腺癌組織中FOXM1蛋白表達高于癌旁組織(P<0.05)。

2.3 乳腺癌組織中miR-214與FOXM1 mRNA的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，乳腺癌組織中miR-214和FOXM1 mRNA的表達呈負相關(guān)(r=-0.729，P<0.05)。

2.4 miR-214表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中miR-214表達與患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05),而與年齡、絕經(jīng)、腫瘤最大直徑、組織學分級及ER、PR、HER-2無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 miR-214表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系±s)

2.5 FOXM1 mRNA和蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中FOXM1 mRNA和蛋白表達與患者腫瘤組織學分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P均<0.05),而與年齡、絕經(jīng)、腫瘤最大直徑及ER、PR、HER-2均無關(guān)(P均>0.05)。見表2。

3 討論

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因參與的復雜生物學過程，多種癌基因的異常表達，多種抑癌基因的失活，DNA錯配修復功能的缺失，導致細胞無限增殖，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。miRNA是一類內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)miRNA作為癌基因或抑癌基因在多種惡性腫瘤中表達異常，影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為，已成為目前腫瘤研究及基因治療的熱點問題。miR-214是近期發(fā)現(xiàn)的miRNA家族重要成員之一，目前研究顯示miR-214在諸多惡性腫瘤中表達異常，扮演癌基因或抑癌基因的角色，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wang等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-214在膠質(zhì)瘤中表達降低，且與膠質(zhì)瘤的病理分級呈負相關(guān)，起抑癌基因的作用。Penna等[8]在研究中報道m(xù)iR-214 在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系及黑色素瘤組織中表達異常增高，可能起癌基因作用。Derfoul等[9]發(fā)現(xiàn)miR-214在人非轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MCF-7及轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231中表達明顯降低，且轉(zhuǎn)移性細胞系比非轉(zhuǎn)移性細胞系中miR-214 水平更低。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-214在乳腺癌組織中表達較相應(yīng)癌旁組織低，差異有統(tǒng)計學意義，提示miR-214在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起抑癌基因作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR-214表達與患者TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),Ⅲ～Ⅳ期組織中miR-214水平低于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學意義；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中miR-214水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中，差異有統(tǒng)計學意義，提示miR-214異常表達減低與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

表2 FOXM1 mRNA和蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系±s)

FOXM1是Forkhead蛋白家族中的重要成員，基因定位于12p13.3，含有110個氨基酸，在調(diào)控細胞周期、紡錘體裝配、染色體分離等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在胃癌[10]、胰腺癌[11]、食管鱗癌[12]等多種實體腫瘤中表達異常增高，且與患者的不良預后有關(guān)。FOXM1能促進腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡，參與PI3K/AKT、Raf/ MEK/MAPK、Akt/Snail等多個重要信號途徑，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1 mRNA和蛋白在乳腺癌組織中表達均較相應(yīng)癌旁組織升高，差異有統(tǒng)計學意義，提示FOXM1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起癌基因作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中FOXM1 mRNA表達與腫瘤組織學分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),Ⅲ～Ⅳ期組織中FOXM1 mRNA水平高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中FOXM1 mRNA水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中，Ⅱ～Ⅲ級組織中FOXM1 mRNA水平高于Ⅰ級，差異均有統(tǒng)計學意義，提示FOXM1異常表達增高與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

某個特定的miRNA可調(diào)控多個靶基因，而某個特定的靶基因可受多個miRNA調(diào)控。目前已證實有諸多miRNA與靶基因共同作用參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程[14]。近期Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214能通過靶向調(diào)控FOXM1基因表達，影響宮頸癌細胞的遷移、侵襲和對化療藥物的敏感性，提示miR-214能調(diào)控FOXM1表達共同參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-214和FOXM1 mRNA表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示miR-214與FOXM1可能在乳腺癌中亦存在靶向調(diào)控關(guān)系，共同作用參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜述所述，乳腺癌組織中miR-214表達異常降低，F(xiàn)OXM1表達異常增高;二者共同作用參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。