湯永喆，王 杰，何 奇

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院乳腺科，上海200030

乳腺癌已成為中國(guó)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］。乳腺癌患者的基因損傷修復(fù)能力較正常人相比有退化。

非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)途徑是DNA損傷修復(fù)過程中極為重要的一部分，NEHJ途徑通過多種功能性蛋白分子復(fù)合來發(fā)揮作用，這其中減數(shù)分裂重組蛋白11同系物A（meiotic recombination 11 homolog A，MRE11）是負(fù)責(zé)招募并組成蛋白復(fù)合體的重要組成部分［2-3］，對(duì)MRE11的檢測(cè)間接說明了其 NHEJ 修復(fù)的程度［4-5］。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene l，BRCA1）是已明確的乳腺癌易感基因［6-7］。

本研究中經(jīng)過對(duì)部分乳腺癌患者及其直系家庭成員進(jìn)行血液樣品的采集與檢測(cè)，篩選出已知乳腺癌致病基因突變7種、意義不明突變6種以及疑似致病基因突變38種。經(jīng)過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，上皮鈣黏蛋白編碼基因（E-cadherin gene，CDH1）的1018位點(diǎn)錯(cuò)義突變c.1018A＞G（p.Thr340Ala）極有可能是一種致病突變類型，針對(duì)該位點(diǎn)突變，本研究利用DNA損傷修復(fù)過程中的NHEJ途徑的報(bào)告系統(tǒng)，對(duì)該突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

MDA-MB-231細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，CDH1基因質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司（圖1），CDH1抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，MRE11抗體、BRCA1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，β-actin抗體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；NHEJ報(bào)告系統(tǒng)由南京金凱瑞基因公司合成。共收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院乳腺科65份乳腺癌患者全血樣品，于深圳華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)。

圖 1 CDH1-pcDNA3.1 質(zhì)粒圖譜Fig. 1 The plasmid profile of CDH1-pcDNA3.1

1.2 方法

1.2.1 致病基因突變位點(diǎn)的篩查

本研究選取2014年5月—2017年5月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院活檢或手術(shù)后病理確診為乳腺惡性腫瘤的患者共65例，收集患者血液樣本檢測(cè)?；颊呔鶠榕?，年齡24～56歲，中位年齡34歲?；颊叽嬖谝欢ǖ倪z傳性乳腺癌高危因素，如在詢問病史過程中發(fā)現(xiàn)患者具有血緣關(guān)系的三級(jí)親屬中存在至少一種腫瘤家族史（乳腺癌、卵巢癌、胃癌及前列腺癌等，雙側(cè)乳腺癌患者，患者發(fā)病年齡小于45歲等）。在本研究中受檢的65份血液樣本中，31例患者未發(fā)現(xiàn)突變基因；6例患者中存在已知致病基因突變共6種，23例患者發(fā)現(xiàn)意義不明突變38種，5例患者中發(fā)現(xiàn)疑似致病基因突變7種（表1）。其中1例28歲女性患者，經(jīng)病理確診左側(cè)乳腺癌，其家族中雖然父母均未患病，但外公、外婆、阿姨、奶奶均為乳腺癌患者，故推測(cè)該患者罹患病癥為家族性隱性遺傳性乳腺癌（家系圖見圖2）。對(duì)其全血樣品進(jìn)行乳腺癌致病基因篩選，經(jīng)遺傳分子檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)該患者CDH1基因（NM_004360）第1018位點(diǎn)發(fā)生突變（c.1018 A＞G）導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了改變（p.Thr340Ala），該遺傳方式符合孟德爾遺傳定律，故選取該基因位點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表 1 遺傳性乳腺癌/卵巢癌基因檢測(cè)結(jié)果匯總表Tab. 1 Summary of genetic testing results for breast cancer/ovarian cancer

圖 2 乳腺癌患者家系圖Fig. 2 The pedigree of a breast cancer patient

1.2.2 CDH1-KO細(xì)胞系的構(gòu)建

利用CRISPR/cas9系統(tǒng)構(gòu)建CDH1-gRNA，序列為5’-CACCGGAGAGACACTGCCAA CTGGC-3’，將cas9質(zhì)粒與gRNA質(zhì)粒按1∶1的比例轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞系，48～60 h后將細(xì)胞進(jìn)行稀釋培養(yǎng)，挑取單克隆細(xì)胞后接種入24孔板，提取基因組DNA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，得到CDH1敲除（CDH1-knockout，CDH1-KO）細(xì)胞系。

1.2.3 CDH1基因及其突變體對(duì)細(xì)胞增殖的影響

CDH1基因突變體（NM_004360）c.1018 A＞G質(zhì)粒，采用定點(diǎn)突變PCR技術(shù)，由長(zhǎng)片段引物擴(kuò)增后得到。將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）、CDH1基因質(zhì)粒（CDH1）以及CDH1-1018位點(diǎn)突變質(zhì)粒（CDH1-1018）分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入CDH1-KO細(xì)胞系，取24、36、48、60和72 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)，利用MTT法對(duì)細(xì)胞增殖率進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 CDH1基因點(diǎn)突變對(duì)DNA損傷修復(fù)效率的影響

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了一種綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的NHEJ報(bào)告系統(tǒng)［2］，該系統(tǒng)被一個(gè)上游的、翻譯移碼的起始位點(diǎn)（Koz-ATG） 所抑制，經(jīng)過i-sceⅠ酶切造成DNA雙鏈斷裂后，Koz-ATG會(huì)被切除，之后DNA末端的修復(fù)會(huì)允許GFP在正確的翻譯框中進(jìn)行翻譯，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，按照GFP會(huì)正常發(fā)光的概率，可以估算出損傷后DNA修復(fù)的效率［8］。

將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）作為對(duì)照，將CDH1基因質(zhì)粒（CDH1）與CDH1-1018位點(diǎn)突變體質(zhì)粒（CDH1-1018）轉(zhuǎn)染進(jìn)入CDH1-KO細(xì)胞系，于48 h用i-sceⅠ酶進(jìn)行酶切，收集細(xì)胞并采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 CDH1基因突變對(duì)DNA損傷修復(fù)過程中相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況的影響

將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）作為對(duì)照，將CDH1基因質(zhì)粒（CDH1）與CDH1-1018位點(diǎn)突變體質(zhì)粒（CDH1-1018）轉(zhuǎn)染CDH1-KO細(xì)胞系，收集細(xì)胞制備蛋白樣品，對(duì)NHEJ修復(fù)途徑相關(guān)蛋白MRE11及乳腺癌相關(guān)蛋白BRCA1的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖率檢測(cè)結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CDH1-KO細(xì)胞系的構(gòu)建

CRISPR/Cas9與gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，挑取單克隆細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，通過PCR及Western blot檢測(cè)驗(yàn)證CDH1-KO細(xì)胞系建立并已成功挑取單克隆株培養(yǎng)（圖3、4）。

2.2 CDH1基因及其突變體對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）、CDH1野生型基因質(zhì)粒（CDH1）以及CDH1-1018位點(diǎn)突變質(zhì)粒（CDH1-1018）分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，取24、36、48、60和72 h共5個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，使用MTT法對(duì)3種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測(cè)（圖5）。

圖 3 CDH1-KO細(xì)胞系PCR結(jié)果圖Fig. 3 PCR results of the CDH1-KO cancer cell lines

MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDH1基因?qū)?xì)胞的增殖能力具有一定的影響，對(duì)比轉(zhuǎn)染空載的CDH1-KO細(xì)胞株，CDH1回補(bǔ)細(xì)胞株的增殖能力大幅提升（P＜0.01），而且CDH1-1018位點(diǎn)突變細(xì)胞回補(bǔ)株的增殖能力不如CDH1野生株（P＜0.05）。

圖 4 Western blot檢測(cè)CDH1-KO細(xì)胞系蛋白表達(dá)情況Fig. 4 The protein expression in CDH1-KO cancer cell line detected by Western blot

圖 5 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示CDH1基因及CDH1-1018突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖率Fig. 5 MTT assay indicated cell proliferation rate after CDH1-KO cells were transfected with CDH1 and CDH1-1018 plasmid

2.3 CDH1基因點(diǎn)突變對(duì)DNA損傷修復(fù)效率的影響

運(yùn)用NHEJ報(bào)告系統(tǒng)（圖6）對(duì)DNA損傷修復(fù)效果進(jìn)行驗(yàn)證，報(bào)告系統(tǒng)中GFP熒光強(qiáng)度間接反映在DNA損傷修復(fù)過程中NHEJ途徑的效率。將報(bào)告系統(tǒng)與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CDH1-KO細(xì)胞株中，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行綠色熒光檢測(cè)（圖7）。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP熒光效率，結(jié)果表明，CDH1基因參與了NHEJ修復(fù)途徑，在回補(bǔ)CDH1基因后，NHEJ損傷修復(fù)效率有了明顯升高（P＜0.01）。而回補(bǔ)CDH1-1018位點(diǎn)突變體質(zhì)粒后，NHEJ修復(fù)效率有所升高（P＜0.05），但低于回補(bǔ)CDH1質(zhì)粒的效率。

圖 6 NHEJ報(bào)告系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig. 6 NHEJ reporting system structure

圖 7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)i-sceⅠ酶切后GFP熒光效率Fig. 7 Detection of GFP by flow cytometry after i-sceⅠ enzyme digestion

2.4 CDH1基因突變對(duì)DNA損傷修復(fù)過程中相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況的影響

在CDH1-KO細(xì)胞系中，將pcDNA3.1空載質(zhì)粒（EV）、CDH1野生型基因質(zhì)粒（CDH1）以及CDH1-1018位點(diǎn)突變質(zhì)粒（CDH1-1018）分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，并檢測(cè)NHEJ修復(fù)途徑中相關(guān)蛋白MRE11及乳腺癌相關(guān)蛋白BRCA1等的表達(dá)情況，β-actin作為內(nèi)參。

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，NHEJ修復(fù)途徑中的關(guān)鍵蛋白分子MRE11在CDH1-KO細(xì)胞中表達(dá)很弱，回補(bǔ)CDH1野生型質(zhì)粒后MRE11有很大程度上的表達(dá)恢復(fù)，而回補(bǔ)CDH1-1018位點(diǎn)突變型質(zhì)粒后，MRE11的表達(dá)量有所恢復(fù)，但其程度相較CDH1野生型質(zhì)?；匮a(bǔ)效果較弱；對(duì)BRCA1蛋白表達(dá)量的檢測(cè)，則說明了CDH1基因?qū)RCA1蛋白表達(dá)的促進(jìn)效果：CDH1野生型質(zhì)粒回補(bǔ)后，BRCA1蛋白表達(dá)量較高，CDH1-1018位點(diǎn)突變質(zhì)?；匮a(bǔ)后，BRCA1蛋白表達(dá)量略見升高，但其效果弱于前者（圖8）。

圖 8 Western blot法檢測(cè)CDH1基因質(zhì)粒以及CDH1-1018位點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CDH1-KO細(xì)胞系后MRE11蛋白及BRCA1蛋白Fig. 8 Western blot results of MRE11 protein and BRCA1 protein after CDH1-KO cell line was transfected with CDH1 and CDH1-1018 plasmids

3 討 論

CDH1基因表達(dá)強(qiáng)弱對(duì)細(xì)胞的增殖能力具有一定的影響，且CDH1-1018位點(diǎn)突變細(xì)胞株的增殖能力弱于野生型CDH1細(xì)胞株，說明該位點(diǎn)的突變可影響細(xì)胞增殖，具有研究?jī)r(jià)值。

通過NHEJ報(bào)告系統(tǒng)與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNA損傷后GFP熒光效率，說明CDH1基因?qū)τ贜HEJ修復(fù)途徑的重要性。而且回補(bǔ)CDH1-1018位點(diǎn)突變體后，DNA損傷修復(fù)過程中NHEJ途徑的效率比野生型CDH1有所降低，說明CDH1基因第1018位點(diǎn)A＞G的突變可使NHEJ修復(fù)方式的效率降低，由此推測(cè)此位點(diǎn)的突變類型很可能為致病突變，會(huì)引起DNA損傷修復(fù)過程的減弱。

通過對(duì)NHEJ修復(fù)途徑中的關(guān)鍵蛋白分子MRE11的檢測(cè)，表明CDH1基因?qū)HEJ途徑的影響顯著。回補(bǔ)CDH1-1018位點(diǎn)突變質(zhì)粒后，MRE11的表達(dá)量回升效率低于野生型CDH1，說明1018位的突變對(duì)MRE11的表達(dá)有一定程度的抑制作用；同時(shí)，也說明該位點(diǎn)的突變對(duì)NHEJ修復(fù)途徑有較大影響。本研究通過對(duì)BRCA1蛋白表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CDH1基因?qū)RCA1蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用，CDH1-1018位點(diǎn)突變質(zhì)?；匮a(bǔ)后，BRCA1蛋白的表達(dá)量有所降低。

有研究顯示［9］，CDH1基因與細(xì)胞間黏附性相關(guān)，我們推測(cè)，CDH1基因1018位A＞G位點(diǎn)突變后，會(huì)使得細(xì)胞浸潤(rùn)能力減弱，DNA修復(fù)過程中蛋白招募過程變慢，從而使得細(xì)胞的整體損傷修復(fù)效率降低，在乳腺癌易感基因群體中，該基因1018位點(diǎn)的突變，很可能是與其他基因突變共同作用造成細(xì)胞損傷，最終使重要位點(diǎn)分子受到影響而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。