習(xí)海濤，陳華，張帆，劉曉明，付養(yǎng)華，趙軍招

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 生殖中心，浙江 溫州 325027）

體外受精聯(lián)合凍胚移植技術(shù)（in vitro fertilization frozen embryo transfer，IVF-FET）受精率約為70%，大約只有一半的正常受精的胚胎發(fā)育到第3天，而只有33%的胚胎能夠發(fā)育至囊胚[1-2]。異常的胚胎的基因激活后發(fā)育阻滯，而形成的囊胚則具有較好的胚胎著床能力[3]。人們進(jìn)行第3天胚胎移植時(shí)，并不知道什么樣的胚胎能發(fā)育成囊胚，甚至?xí)⒒虍惓５呐咛ミM(jìn)行移植[4]。

冷凍移植具備提高累積妊娠率、減少促排卵次數(shù)、降低卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）發(fā)生率、降低異位妊娠風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)[5]。但由于試管嬰兒起步階段流行凍存第3天卵裂期胚胎或因囊胚培養(yǎng)的技術(shù)的不成熟，許多中心并未將所有的胚胎培養(yǎng)至囊胚進(jìn)行移植或冷凍，而是凍存了很多的卵裂期的胚胎。本研究對于卵裂期冷凍胚胎較多患者，將對照組卵裂期第3天胚胎解凍與實(shí)驗(yàn)組提前解凍培養(yǎng)至第5天后的胚胎植入率與臨床妊娠率進(jìn)行比較，以探討第3天卵裂期的解凍胚胎的發(fā)育潛能。

1 對象和方法

1.1 對象 將2012年3月至2016年3月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖中心進(jìn)行冷凍移植周期（frozen transplant cycle，F(xiàn)ET），對于卵裂期冷凍胚胎較多的患者（2管以上），將解凍胚胎均為完胚列入本研究中，其中FET周期122個(gè)，解凍胚胎185枚。本研究通過本院倫理委員論證，所有患者均簽署相應(yīng)的知情同意書。

1.2 研究分組 將解凍均為存活的第3天胚胎的FET隨機(jī)分為以下2組：A組為當(dāng)天解凍第3天胚胎培養(yǎng)2 h后移植，共計(jì)64個(gè)周期，解凍存活90個(gè)胚胎；B組為第3天胚胎解凍培養(yǎng)至第5天（培養(yǎng)約48 h）后移植，共計(jì)58個(gè)周期，解凍存活95個(gè)胚胎。記錄B組第3天冷凍胚胎提前解凍培養(yǎng)至第5天的胚胎發(fā)育情況，將解凍胚胎培養(yǎng)后移植前有胚胎發(fā)育成囊胚或早期囊胚的作為BI組；將細(xì)胞數(shù)增加，均無胚胎發(fā)育成囊胚的周期作為BII；培養(yǎng)后所移植胚胎細(xì)胞均未增加的作為BIII組，觀察并記錄臨床效果。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)膜準(zhǔn)備：為減少內(nèi)膜不同準(zhǔn)備方案所帶來的差異，列入本研究的所有周期均為激素替代周期。激素替代周期用于閉經(jīng)、月經(jīng)不規(guī)律、無排卵且對克羅米芬及小劑量人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）無反應(yīng)的患者，于月經(jīng)周期第2～第3天口服補(bǔ)佳樂2～9 mg（德國拜耳醫(yī)藥公司），根據(jù)內(nèi)膜生長情況調(diào)整劑量及用藥天數(shù)。

1.3.2 胚胎移植時(shí)間：激素替代周期主要依據(jù)陰道B超下子宮內(nèi)膜厚度，當(dāng)≥8 mm時(shí)肌注黃體酮使內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組于內(nèi)膜準(zhǔn)備（黃體酮注射的72 h或120 h左右）即第3天或第5天進(jìn)行胚胎移植，同時(shí)還要參考血中的雌激素和孕激素水平。

1.3.3 黃體支持：激素替代周期組用雌激素（補(bǔ)佳樂）+黃體酮支持，移植后依據(jù)患者情況連續(xù)或間斷給人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）支持。

1.3.4 胚胎凍融方法：根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評分方法，將評價(jià)為優(yōu)質(zhì)胚胎予以玻璃化冷凍，解凍采用快速復(fù)蘇法[6]。

1.3.5 妊娠結(jié)局的判定[7]：于移植后第14天測尿妊娠試驗(yàn)及血β-HCG以確定有無妊娠；如β-HCG＞25 mIU/mL為生化妊娠；如患者于移植后28 d陰道B超見宮內(nèi)有孕囊，確定為臨床妊娠。平均移植胚胎個(gè)數(shù)=所有周期移植胚胎總個(gè)數(shù)/總周期數(shù)；胚胎種植率=胚胎種植個(gè)數(shù)/所有周期移植胚胎總個(gè)數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總周期數(shù)；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)

1.3.6 移植后隨訪：懷孕前3個(gè)月于本中心隨診，之后采用電話隨訪。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，2組間的比較用成組t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD方法；多組間率的比較用Fisher確切概率法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12組患者一般情況比較 2組患者臨床因素、年齡、HCG日內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.22組臨床效果比較 2組提前解凍培養(yǎng)至第5天胚胎種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 多組臨床效果比較 BI組、BII組、BIII分別與A組比較，提前解凍培養(yǎng)至第5天胚胎發(fā)育至不同階段，BI組在臨床妊娠率上高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與A組比，BI組在胚胎種植率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與A組比，BIII組在胚胎種植率、胚胎臨床妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表12組患者一般情況的比較

表2 提前解凍培養(yǎng)至第5天胚胎移植的臨床效果比較

表3 提前解凍培養(yǎng)至第5天胚胎發(fā)育至不同階段臨床效果比較

3 討論

輔助生殖技術(shù)雖然快速發(fā)展，但目前活產(chǎn)率仍不甚理想。胚胎移植是影響人輔助生殖技術(shù)成功的關(guān)鍵因素之一[8]。商業(yè)化的序貫培養(yǎng)液的應(yīng)用提高了胚胎由卵裂期發(fā)育到囊胚的概率，由于囊胚較高的植入率，很多生殖中心由此改變原有的移植策略，將移植卵裂期的胚胎改為囊胚，在不影響成功率的條件下單胚胎移植得以開展，用以降低多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

有學(xué)者認(rèn)為[8]在胚胎培養(yǎng)過程中第3天的卵裂期胚胎發(fā)育至第5天的囊胚，體內(nèi)環(huán)境更適合胚胎發(fā)育的需要，但本研究結(jié)果顯示提前2天解凍的胚胎在體外培養(yǎng)并沒有顯示出比卵裂胚胎解凍后直接移植進(jìn)入體內(nèi)環(huán)境的臨床結(jié)果差，兩者比較差異并沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；因此，卵裂期胚胎生長環(huán)境更適于體內(nèi)或者體外，在本研究中并沒有顯示出明顯差別，經(jīng)過近10年的努力，序貫培養(yǎng)液的應(yīng)用顯著提高了胚胎的體外培養(yǎng)技術(shù)，使體外培養(yǎng)的環(huán)境與體內(nèi)的差異日漸縮小，使之更接近于體內(nèi)環(huán)境。

體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育也遵從自然選擇的法則，能發(fā)育至囊胚并進(jìn)行移植，就意味著高的妊娠率，移植前基因診斷的開展也證實(shí)了這一假設(shè)。第3天優(yōu)質(zhì)胚胎有59%為非整倍體，而在好的囊胚中這個(gè)比例僅占1/3，明顯可以看出，好的囊胚的異常率明顯低于第3天卵裂期的胚胎[10]。本研究顯示，提前2天解凍的卵裂期的胚胎能夠進(jìn)一步發(fā)育（細(xì)胞個(gè)數(shù)增加或發(fā)育至早期囊胚）所占周期數(shù)的比例約為91.38%（53/58），而解凍后胚胎存活但并沒有進(jìn)一步發(fā)育的周期數(shù)比例則高達(dá)8.62%（5/58），也間接證明了目前的胚胎形態(tài)學(xué)評分體系并不能完美地將非整倍體的異常胚胎挑選出來，本研究也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

本研究可以找到改變移植策略帶來較高妊娠率的根本原因。本研究中第3天胚胎提前解凍培養(yǎng)至第5天，在BI組（發(fā)育至囊胚）臨床妊娠率高于A組（66.67%vs. 37.5%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；盡管在胚胎種植率上并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在數(shù)值比較上BI組比A組（46.15%vs. 31.11%）高出很多。這和很多研究的結(jié)果相一致[1，11-12]；同時(shí)這些卵裂期胚胎解凍后的進(jìn)一步發(fā)育顯示了經(jīng)過冷凍解凍，仍具有良好的發(fā)育潛能和臨床應(yīng)用前景；解凍后培養(yǎng)發(fā)育至囊胚也預(yù)示著這個(gè)冷凍周期將有好的結(jié)局。

但在B組58個(gè)周期中，BIII組有5個(gè)周期，顯示胚胎解凍后存活但并沒有進(jìn)一步發(fā)育的周期數(shù)比例則高達(dá)8.62%（5/58），胚胎發(fā)育阻滯，這有可能是導(dǎo)致卵裂期冷凍胚胎移植臨床妊娠率一直在較低水平徘徊的重要原因；無論是從BIII組的胚胎種植率和臨床妊娠率上都證明了這一點(diǎn)。當(dāng)然從另一個(gè)側(cè)面來看，卵裂期冷凍胚胎提前解凍，對于那些胚胎存活但并沒有進(jìn)一步發(fā)育的周期來說，是否取消周期或再行解凍以及預(yù)測臨床結(jié)果，可以提供一個(gè)很好的參考。

本研究提示將第3天胚胎提前解凍，體外培養(yǎng)至第5天并不影響臨床效果，而且可以提前評估冷凍移植周期的臨床效果。