王綠音 張 慧* 李 懿 張 偉 梁成罡*

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050）

醋酸去氨加壓素為天然精氨鹽加壓素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，即1-半胱氨酸脫去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸[1]?；瘜W(xué)名：巰基丙酰-L-酪氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰氨酰-L-天冬酰氨酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酰-L-甘氨酰胺醋酸鹽（1，6-二硫環(huán)）[2]。臨床上被廣泛用于治療兒童夜尿癥[3]、尿崩癥[4]、輕度血友病及血管性血友病[5]。醋酸去氨加壓素及注射液美國(guó)藥典[6]與中國(guó)藥典[7]均有收載。雜質(zhì)Ⅰ為醋酸去氨加壓素主要降解產(chǎn)物，由肽鏈中的谷氨酰胺脫氨形成谷氨酸而得。中國(guó)藥典2015版二部醋酸去氨加壓素品種項(xiàng)下采用雜質(zhì)Ⅰ與主成分的分離度來(lái)考察系統(tǒng)是否適用及對(duì)雜質(zhì)Ⅰ進(jìn)行定位，同時(shí)采用主成分自身對(duì)照法對(duì)雜質(zhì)Ⅰ的含量進(jìn)行了控制，限度控制在0.5%[7]。因此，醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ國(guó)家對(duì)照品的研制對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的順利實(shí)施、市場(chǎng)監(jiān)管和生產(chǎn)企業(yè)放行都有很重要的意義。

本研究對(duì)醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證、純度分析并采用質(zhì)量平衡法確定含量，建立了首批醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ對(duì)照品，本品適用于中國(guó)藥典醋酸去氨加壓素及制劑中的雜質(zhì)定位和鑒別。

1 儀器與材料（試藥）

1.1 儀器：Metrohm 851水分測(cè)定儀，島津LC-10AD高效液相色譜儀，安捷倫1260高效液相色譜儀，9.4T Q-FT-ICR-MS（Bruker）質(zhì)譜儀，Synapt HD ESI-MS/MS質(zhì)譜儀。

1.2 材料：醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ原料購(gòu)于深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：150203），18種氨基酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)140624-200805），PITC（J&K），醋酸去氨加壓素對(duì)照品（中檢院，140717-200901）醋酸，醋酸鈉，鹽酸，三乙胺，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，二硫蘇糖醇為分析純，乙腈，甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)確證

2.1.1 分子量測(cè)定[8]：儀器為Apex II型傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀9.4T Q-FT-ICR-MS，正離子檢測(cè)模式，離子源ESI，源溫150 ℃進(jìn)行分子量測(cè)定，圖1中m/z 1070.417為待標(biāo)品實(shí)際檢測(cè)的分子離子峰[M+H]+，與理論分子量一致（理論分子量為1070）。

2.1.2 序列分析[8]：儀器為Synapt HD ESI-MS/MS檢測(cè)條件為：正離子檢測(cè)方式，毛細(xì)管電壓0.8～2 kV，cone電壓35 eV，collision電壓25～40 eV，MCP檢測(cè)器電壓2300 eV，離子源ESI，源溫80 ℃進(jìn)行多肽序列分析，待標(biāo)品溶液用二硫蘇糖醇（DTT）還原二硫鍵，還原后的樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析（圖2）。對(duì)圖2 中雙電荷m/z為536.65的串聯(lián)質(zhì)譜分析（TOF MSMS）圖譜見(jiàn)圖3，分析結(jié)果待標(biāo)品部分氨基酸序列為YFENCPRG-NH2，同時(shí)測(cè)定醋酸去氨加壓素國(guó)家對(duì)照品的氨基酸序列為YFQNCPRG-NH2，比較上述兩個(gè)氨基酸序列可以推斷，雜質(zhì)Ⅰ待標(biāo)品的氨基酸組成中的谷氨酸替代了醋酸去氨加壓素中的谷氨酰胺，其他氨基酸一致。

圖1 醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ分子量質(zhì)譜圖

圖2 醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ一級(jí)質(zhì)譜

圖3 雙電荷m/z為536.65的串聯(lián)質(zhì)譜分析圖譜

圖4 醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ的RP-HPLC色譜圖

2.2 純度分析[7]：采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以0.067 mol/L磷酸氫二鈉和0.067 mol/L磷酸二氫鉀（pH 7.0）為流動(dòng)相A；乙腈為流動(dòng)相B；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。洗脫梯度的初始狀態(tài)為12%B相，保持4 min，在14 min內(nèi)將B相增至21%，然后在17 min內(nèi)將B相增至26%，再在5 min內(nèi)將B相降為12%，保持10 min。稱(chēng)取待標(biāo)品適量，加水制成1 mg/mL的溶液，取50 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計(jì)算，結(jié)果為99.88%。圖4所示為系統(tǒng)適用性樣品色譜圖，可見(jiàn)雜質(zhì)Ⅰ在醋酸去氨加壓素之前出峰，二者可有效分離。

2.3 氨基酸組成分析：采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以0.1 mol/L醋酸鈉-乙腈（93∶7）為流動(dòng)相A，乙腈-水（4∶1）為流動(dòng)相B，流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。洗脫梯度的初始狀態(tài)為100%A相，在8 min內(nèi)將B相增至15%，然后在9 min內(nèi)將B相增至34%，再在3 min內(nèi)將B相增至100%，保持4 min，在回到初始狀態(tài)。分別稱(chēng)取待標(biāo)品及8中氨基酸對(duì)照品適量，進(jìn)行水解，并進(jìn)行柱前異硫氰酸苯酯（PITC）衍生，進(jìn)行液相檢測(cè)。結(jié)果表明（表1），酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸等8個(gè)氨基酸比值的測(cè)定結(jié)果均符合中國(guó)藥典2015版二部醋酸去氨加壓素項(xiàng)下的規(guī)定。

表1 氨基酸比值結(jié)果

2.4 理化性質(zhì)分析：①性狀：醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ為白色粉末。在純水和1%醋酸中易溶，在乙醇溶液中可溶。②化學(xué)鑒別：取待標(biāo)品適量，加水制成約1 mg/mL的溶液，加入雙縮脲試劑1 mL，溶液顯藍(lán)紫色。③水分：采用Metrohm 851水分測(cè)定儀對(duì)分裝后待標(biāo)品樣品進(jìn)行了卡氏庫(kù)侖法測(cè)定水分，結(jié)果為3.597%。④酸度：用純水制成約2.5 mg/mL溶液，溶液的pH值為4.6。⑤溶液顏色與澄清度：用純水制成約2.5 mg/mL溶液，為澄清無(wú)色溶液。⑥醋酸：采用中國(guó)藥典2015版四部通則0872合成多肽中醋酸測(cè)定法[9]進(jìn)行HPLC法醋酸含量測(cè)定，結(jié)果為4.28%。

2.5 量值確定：根據(jù)水分和純度的測(cè)定結(jié)果，以質(zhì)量平衡法計(jì)算，本批對(duì)照品的含量（%）=（100%-水分%-醋酸%）×HPLC純度%=92.012%，修約為92.0%。

3 結(jié)果與討論

近年來(lái)，世界范圍內(nèi)對(duì)合成肽類(lèi)藥物的研發(fā)正迎來(lái)一個(gè)新的高潮。從各國(guó)監(jiān)管方審評(píng)審批以及技術(shù)指南的角度，對(duì)合成肽類(lèi)藥物研發(fā)中工藝相關(guān)和降解相關(guān)的有關(guān)物質(zhì)質(zhì)控要求達(dá)到了一個(gè)新的高度。在已上市合成肽類(lèi)藥物的標(biāo)準(zhǔn)提高研究、藥典標(biāo)準(zhǔn)起草和修訂過(guò)程中，基于已知產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的系統(tǒng)適用性要求、雜質(zhì)及有關(guān)物質(zhì)的定性定量要求，已成為關(guān)注要點(diǎn)。

中國(guó)藥典（Chp2015）及美國(guó)藥典（USP41-NF36）醋酸去氨加壓素品種項(xiàng)下均采用主成分作為對(duì)照的方法進(jìn)行雜質(zhì)的控制，USP41-NF36僅采用縮宮素與主成分的分離度作為考察系統(tǒng)適用性的指標(biāo)，Chp2015則要求醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ與主成分的分離度。研究發(fā)現(xiàn)，采用Chp2015的方法所得的色譜圖中，縮宮素峰與主成分峰的相對(duì)保留時(shí)間（RRT）為3.28，雜質(zhì)Ⅰ與主成分峰的RRT為0.95。上述結(jié)果表明，醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ本身為醋酸加壓素的降解產(chǎn)物，其與主峰的分離特性比縮宮素更能反映系統(tǒng)適用性。

采用質(zhì)譜法對(duì)醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，因雜質(zhì)Ⅰ結(jié)構(gòu)中1位的巰基丙酰及本品全序列的特性，使得質(zhì)譜無(wú)法測(cè)得其準(zhǔn)確信息。故同時(shí)測(cè)定了醋酸去氨加壓素的氨基酸序列，通過(guò)比較二者測(cè)得序列的相似性，進(jìn)一步佐證所測(cè)雜質(zhì)Ⅰ氨基酸序列的正確。氨基酸組成的分析結(jié)果中，除半胱氨酸外其余各氨基酸比值均與理論值一致。這是因?yàn)榘腚装彼嵩谒鈺r(shí)易降解，故所測(cè)比值偏低，但仍符合中國(guó)藥典2015版二部醋酸去氨加壓素項(xiàng)下的規(guī)定 。本研究通過(guò)化學(xué)反應(yīng)、質(zhì)譜分子量、二級(jí)質(zhì)譜以及氨基酸測(cè)序，對(duì)醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。按質(zhì)量平衡法計(jì)算其含量，本批對(duì)照品的含量為92.0%，反相液相色譜法分析結(jié)果表明，本品與主成分醋酸去氨加壓素可以很好分離，分離度達(dá)到5.2，可用于醋酸去氨加壓素及制劑標(biāo)準(zhǔn)中醋酸去氨加壓素雜質(zhì)Ⅰ的鑒別和定位，便于去氨加壓素雜質(zhì)進(jìn)行定性控制。