林雅玲，王文遞，許昕瑜，王明亮，宋彬妤，劉曉梁，郭松佳，吳惠文

（山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200）

人體腸道內(nèi)定居大量的微生物，其編碼的基因數(shù)量約是人體自身基因的100倍[1]。腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與人類代謝疾病的發(fā)生關(guān)系密切，膳食結(jié)構(gòu)的變化會引起腸道菌比例的改變，從而對機(jī)體的代謝產(chǎn)生諸多影響。動物及人體研究均發(fā)現(xiàn)，高脂飲食致宿主發(fā)生肥胖且腸道內(nèi)擬桿菌門/厚壁菌門比例下降[2-3]。近年來研究表明[4]，果糖攝入增加與代謝疾病的發(fā)生關(guān)系密切。本研究擬通過高果糖飲食復(fù)制大鼠代謝疾病模型，探討動物腸道內(nèi)擬桿菌屬、乳桿菌屬和梭桿菌屬3種菌屬豐度變化情況及雙歧桿菌干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理

30只雄性SD大鼠，體重200～220 g（購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心），隨機(jī)分為對照組（normal control, NC組），果糖組（high fructose diet, HFD組），雙歧桿菌組（Bifidobacteria, B組），每組各10只。NC組，普通飼料+自來水；HFD組，普通飼料+10%果糖水；B組，普通飼料+10%果糖水+雙歧桿菌水（1ml/d，1×109cfu/ml）灌胃。于16周末收集大鼠糞便。大鼠禁食12h，乙醚麻醉大鼠，腹主動脈采血并分離血漿，取部分肝組織置于4%多聚甲醛溶液固定。

1.2 主要試劑及儀器

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及三酰甘油（TG）測定試劑盒購于南京建成公司，脂多糖（LPS）鱟試劑盒購于美國R&D公司，大鼠胰島素ELISA試劑盒及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）ELISA試劑盒購自上海西唐公司，糞便總DNA提取試劑盒及熒光定量預(yù)混試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司，HAP純化合成方法。雙歧桿菌活菌復(fù)合制劑購于山東向日葵生物科技有限公司（含活菌1×1011cfu/g）?？焖傺莾x（羅氏活力型）。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 體重及血糖 檢測每周監(jiān)測大鼠體重變化，于16周末空腹尾靜脈采血，通過快速血糖儀檢測空腹血糖（FBG）水平。

1.3.2 ALT、AST、TG、LPS及胰島素抵抗指數(shù) 采用酶法測定ALT、AST及TG；鱟試劑法檢測LPS水平；ELISA法檢測大鼠血漿TNF-α水平和空腹胰島素（FINS）水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mu/ml）/22.5。

1.3.3 肝組織病理學(xué) 檢測取4%多聚甲醛溶液，固定肝組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.3.4 腸道菌群基因組DNA 提取16周末采集的大鼠糞便，于大鼠排便后迅速分裝于密閉無菌糞便儲存盒中并將標(biāo)本儲存于-80℃低溫冰箱中。稱取200 mg樣品采用糞便總DNA提取試劑盒提取總菌DNA，微量核酸定量檢測儀檢測DNA濃度。

1.3.5 引物及實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）根據(jù)文獻(xiàn)[5-7]合成引物（見表1）。運(yùn)用PCR技術(shù)分別對總菌、擬桿菌屬、乳桿菌屬和梭桿菌屬的基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系20μl：2×Super Real Color Premi×10μl，正反向引物各0.6μl（10μmol/L），模板75～100ng。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15min；95℃30s，退火30s，72℃ 45s，39個(gè)循環(huán) ；72℃ 5min。觀察各菌屬在果糖飲食及雙歧桿菌干預(yù)后豐度變化。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，體重變化采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重

3組大鼠體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的體重有差異（F=7222.554，P=0.000）；②3組體重有差異（F=34.772，P=0.000）；③ 3 組體重變化趨勢有差異（F=344.756，P=0.000）（見表2）。從7周開始，HFD組較NC組體重增長速度加快（見圖1A），B組從第13周開始較HFD組增長速度減慢（見圖1B）。

2.2 ALT、AST、TG、LPS及TNF-α水平

3組大鼠ALT、AST、LPS、TG及TNF-α比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與NC組比較，HFD組 ALT、AST、LPS、TG 及 TNF-α 升高（t=5.445、4.971、18.519、8.081和 12.142，均P=0.000）；與 HFD 組比較，B組ALT、AST、LPS、TG及TNF-α降低（t=5.009、3.921、11.151、4.679和6.786，均P=0.000）；與NC組比較，B組LPS、TG及TNF-α升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.368、3.652和5.356，P=0.000、0.005和0.000）。見表 3。

2.3 FINS、FBG及HOMA-IR評估

3組大鼠FINS、FBG及HOMA-IR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HFD組 FINS、FBG 及HOMA-IR與NC組比較，HFD組升高（t=4.209、8.217和10.983，均P=0.000）；B組與HFD組比較，各指標(biāo)降低（t=3.149、5.874和8.274，均P=0.000）；B組FBG及HOMA-IR較NC組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.542和2.889，P=0.037和0.019）。見表4。

表2 3組大鼠每周體重均值表（n =10，g）

圖1 大鼠體重變化

表3 3組大鼠ALT、AST、LPS、TG及TNF-α水平比較（n =10，±s）

表3 3組大鼠ALT、AST、LPS、TG及TNF-α水平比較（n =10，±s）

注：1）與NC組比較，P ＜0.05；2）與HFD組比較，P ＜0.05；3）與NC組比較，P ＜0.05

組別 ALT/（u/L） AST/（u/L） LPS/（EU/L） TG/（mmol/L） TNF-α/（ng/ml）NC 組 54.70±8.33 119.5±8.40 0.09±0.01 0.44±0.07 0.72±0.09 HFD 組 79.73±7.61） 178.2±27.251） 0.21±0.021） 1.06±0.161） 1.59±0.131）B 組 58.21±5.92） 135.5±14.252） 0.15±0.012）3） 0.70±0.112）3） 1.10±0.112）3）F值 20.925 14.133 173.995 32.878 74.059 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 3組大鼠FINS、FBG及HOMA-IR結(jié)果比較（n=10，±s）

表4 3組大鼠FINS、FBG及HOMA-IR結(jié)果比較（n=10，±s）

注：1）與NC組比較，P ＜0.05；2）與HFD組比較，P ＜0.05；3）與NC組比較，P ＜0.05

組別 FINS/（mu/L） FBG/（mmol/L） HOMA-IR NC 組 19.90±1.78 4.02±0.68 2.97±0.38 HFD 組 27.70±4.981） 7.67±0.361） 9.36±1.461）B 組 21.70±1.682） 5.06±0.942）3） 4.54±0.512）3）F值 35.835 8.117 65.478 P值 0.000 0.006 0.000

2.4 肝組織病理學(xué)改變

NC組（見圖2A）肝臟呈暗紅色，無油膩感，鏡下可見肝索呈放射狀排列；HFD組（見圖2B）肝臟體積增大，肉眼可見脂肪堆積，呈淡黃色，邊緣鈍圓，鏡下可見胞內(nèi)有脂滴空泡；B組（見圖2C）細(xì)胞內(nèi)脂滴空泡體積和數(shù)量較HFD組均減小。

2.5 菌屬豐度檢測結(jié)果

如圖3所示，與NC組比較，HFD組的擬桿菌屬、乳桿菌屬豐度降低，梭桿菌屬豐度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.131、5.023和5.811，均P=0.000）；與HFD組比較，B組擬桿菌屬、乳桿菌屬豐度增加，梭桿菌屬豐度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.327、4.947和3.913，P=0.009、0.000和0.003）；B組3組菌屬與NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.477、3.273和3.092，P=0.039、0.004和0.013）。LPS水平與各組乳桿菌屬豐度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.637，P=0.016），與梭桿菌屬豐度呈正相關(guān)（r=0.771，P=0.001）。

圖2 各組肝組織病理切片圖（n =10，HE×100）

圖3 各菌屬相對豐度比較

3 討論

代謝性疾病發(fā)病率逐年升高已成為當(dāng)前嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病與遺傳、生活方式及飲食習(xí)慣關(guān)系密切。近年來研究發(fā)現(xiàn)，果糖攝入增加與代謝疾病發(fā)生密切相關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查研究表明，果糖攝入量與非酒精性脂肪肝病炎癥水平呈正相關(guān)[8]。高果糖飲食可引起人體胰島素抵抗和肥胖等代謝疾病[9]。本實(shí)驗(yàn)通過10%的果糖水喂養(yǎng)大鼠8周即發(fā)現(xiàn)，動物體重增加，肝臟損傷（肝細(xì)胞脂變、ALT、AST增高），胰島素敏感性降低（HOMA-IR增高）?？梢姡吖秋嬍炒笫罂勺鳛閺?fù)制代謝疾病的理想模型。

腸道菌群失調(diào)與代謝疾病的發(fā)生密切相關(guān)。TURNBAUGH等[2]通過對154例受試者的腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，肥胖者腸道的細(xì)菌多樣性降低而且擬桿菌門豐度降低。MUSSO等[10]在臨床實(shí)驗(yàn)中指出，糖尿病患者腸道菌群中腸桿菌科等細(xì)菌豐度增加而雙歧桿菌減少。研究普遍認(rèn)為，膳食結(jié)構(gòu)的改變可引起腸道菌群失調(diào)。CANI等[3]發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠腸道中擬桿菌門/厚壁菌門比例下降。HSIEH等[11]在一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高果糖飲食大鼠的腸道菌群中雙歧桿菌含量下降，而毒性梭狀芽胞桿菌含量升高。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠糞便中出現(xiàn)的擬桿菌屬、乳桿菌屬占總菌比例減小，梭桿菌屬占總菌比例增加，而在雙歧桿菌組中上述菌屬的失調(diào)及宿主的代謝紊亂得到改善。由此推測，高果糖膳食引起腸道菌群紊亂在機(jī)體代謝異常中發(fā)揮一定作用。膳食結(jié)構(gòu)改變引起腸道菌群紊亂可通過多方面促發(fā)代謝疾病。膳食可通過使腸道菌群失調(diào)引起全身慢性低度炎癥，促進(jìn)代謝疾病的發(fā)生。研究表明，腸道菌群紊亂可引起腸道屏障功能受損[12-13]，腸道通透性降低，導(dǎo)致代謝性內(nèi)毒素血癥，LPS通過炎癥機(jī)制促進(jìn)肥胖、IR等代謝疾病的發(fā)生[14]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠血漿LPS、TNF-α水平升高，且LPS水平與乳桿菌屬豐度呈負(fù)相關(guān)，與梭桿菌屬呈正相關(guān)，且在雙歧桿菌干預(yù)后，大鼠血漿LPS、TNF-α水平降低，進(jìn)一步證實(shí)果糖飲食引起腸道菌群紊亂通過炎癥機(jī)制在代謝疾病發(fā)病中發(fā)揮一定的作用。腸道菌群紊亂可通過引起能量代謝異常參與代謝疾病的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，高脂飲食小鼠腸道內(nèi)丁酸含量降低，其可使宿主食物攝入增多，腸蠕動減慢[16-17]，引起機(jī)體能量代謝異常，促進(jìn)代謝疾病的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，果糖膳食大鼠腸道內(nèi)2種產(chǎn)丁酸的菌屬豐度發(fā)生了不同變化（擬桿菌屬豐度下降，梭桿菌屬豐度增加），但本實(shí)驗(yàn)未研究腸道菌群失調(diào)對大鼠腸道內(nèi)丁酸含量的影響，此點(diǎn)仍需做進(jìn)一步的研究；雙歧桿菌干預(yù)有助于調(diào)節(jié)菌屬失調(diào)，并對果糖膳食大鼠肥胖、IR及肝臟損傷起改善作用。

綜上所述，果糖飲食引起3種菌屬失調(diào)參與機(jī)體代謝異常的發(fā)生，雙歧桿菌通過調(diào)節(jié)其失調(diào)對機(jī)體代謝紊亂發(fā)揮改善作用。