林源 陶天遵 陶樹清 王聲雨 李超

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)經(jīng)常被用作組織工程學的種子細胞，很容易從成人的骨髓中獲得，具有多能性，如分化為軟骨細胞、成骨細胞和成肌細胞[1]，可作為骨骼修復的主要來源[2]，通過細胞丟失和新細胞生成替代之間的嚴格平衡，人體的組織、器官可以保持穩(wěn)態(tài)[3-4]。然而，隨著衰老和退行性疾病，這種平衡逐漸下降，導致組織完整性和功能受損，同時損傷的是再生能力降低[5]。因此，隨著衰老，BMSCs的功能和數(shù)量下降導致BMSCs修復骨骼和維持骨骼穩(wěn)態(tài)的能力受損[6-8]。以往眾多研究已經(jīng)證實，細胞的衰老過程總是伴隨著端粒的縮短[9]。氧化應激和細胞多次傳代均是誘導BMSCs衰老的有效途徑，但其誘導衰老機制尚不清楚。

在干細胞中，ATM激酶的短缺可能導致端粒的縮短[10]。Lee等[11]發(fā)現(xiàn)，一種PARP1的強抑制劑Olaparib可以促進ATM激酶的活化，進而維持端粒長度。本研究擬通過實驗觀察氧化應激、多次傳代及Olaparib對BMSCs端粒長度的影響，以及端粒長度變化與BMSCs增殖和分化能力的相關性。

1 材料和方法

1.1 動物模型選擇及細胞的原代培養(yǎng)

選取30只3月齡、重量250～300 g的雄性SD大鼠，游離雙側股骨，暴露髓腔，用培養(yǎng)液進行沖洗。將沖出的細胞收集在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育3 d，然后置換培養(yǎng)液。之后，每3 d更換溶液，并使用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長的變化。

1.2 實驗設計及分組

為了研究氧化應激對細胞的影響，將其分為3組，即對照組、100 μmol/L H2O2-2H組(細胞用100 μmol/L H2O2處理2 h)和100 μmol/L H2O2-4H組(細胞用100 μmol/L H2O2處理4 h)。處理后的細胞培養(yǎng)24 h后進行形態(tài)學觀察、β-半乳糖苷酶染色、細胞增殖檢測、端粒長度測定和堿性磷酸酶活性檢測。

為了檢測傳代次數(shù)對BMSCs衰老、增殖和分化的影響，將細胞分為4組(P2、P4、P8和P16)，當細胞傳代至特定代時進行細胞形態(tài)觀察、β-半乳糖苷酶染色、檢測細胞增殖，并測量端粒長度和堿性磷酸酶活性。

為了檢測端粒長度對BMSCs衰老、增殖和分化的影響，將細胞分為4組，即對照組、100 μmol/L H2O2-4H組、3 μmol/L Olaparib-24H組(細胞用3 μmol/L Olaparib處理24 h)和100 μmol/L H2O2-4H+3 μmol/L Olaparib組(Olaparib在加入H2O2之前2 h添加到BMSCs中，與H2O2作用4 h后，再使用Olaparib處理細胞 24 h)。

1.3 試劑和抗體

研究中涉及的動物飼養(yǎng)和動物實驗均經(jīng)動物實驗倫理委員會的批準。β-半乳糖苷酶試劑盒(碧云天)；細胞培養(yǎng)用試劑：DMEM、胎牛血清(FBS)和0.25%胰蛋白酶(Gibco，Grand Island，NY，USA)；CCK-8(Cell Counting Kit-8，Dojindo，日本)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.4 細胞形態(tài)學觀察

用100 μmol/L H2O2溶液處理BMSCs 2 h和4 h后，培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，檢測扁平肥厚細胞的數(shù)量及其在整體細胞中的占比。

1.5 CCK-8分析

將2 000個細胞接種到96孔板的孔中以溫育過夜。用新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基替換原始培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)2周，在此期間每3 d更換一次培養(yǎng)基。此后，將96孔板的每個孔中的培養(yǎng)基換成100 μL DMEM/F12培養(yǎng)基，然后向每個孔中加入10 μL反應劑。再將細胞在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標儀檢測OD450值。

1.6 β-半乳糖苷酶染色

將BMSCs在6孔板中培養(yǎng)，使用β-半乳糖苷酶的固定液在室溫下固定15 min，然后使用PBS洗滌3次。然后使用β-半乳糖苷酶染色溶液將BMSCs染色12 h。染色后，將細胞置于倒置顯微鏡下觀察視野中總細胞中被擴增200倍的陽性細胞的比例。

1.7 端粒長度分析

使用高純度PCR模板制備試劑盒(德國柏林羅氏公司)分離BMSCs的基因組DNA，并使用分光光度法檢測濃度以及DNA的純化。為了分析端粒長度，使用限制性酶I(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)來消化提取的20 μg DNA，然后使用0.8%的瓊脂糖凝膠在60 V的恒定電壓下電泳16 h分離上面的DNA。首先將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到由標準檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液填充的毛細管中，然后轉(zhuǎn)移到陽離子尼龍膜(Osmonics，Minnetonka，MN，USA)上，接著孵育14 h。將尼龍膜用檸檬酸鈉緩沖液洗滌3次后，將尼龍膜在120 ℃下加熱30 min。 然后將膜末端的限制性片段與地高辛標記的端粒(Roche，Berlin，Germany)的寡核苷酸探針雜交。使用緩沖液洗脫額外游離的地高辛標記的探針，然后用脫脂奶堵塞膜以覆蓋由非特異性抗體傳播的位點。將地高辛與堿性磷酸酶的特異性抗體和CDP-Star(Roche，Berlin，Germany)化學發(fā)光底物用于檢測地高辛探針的強度。將具有地高辛抗性的抗體溶液(Roche，Germany)用于孵育30 min。用緩沖液洗滌膜后，將CDP-Star加到含有面朝上的DNA的表面上并均勻鋪展在整個表面，在無光情況下溫育5 min。然后，在暗室進行顯色，用Image QuantTM RT ECLTM處理獲得圖像，并使用Telometric 1.2軟件計算端粒長度。

1.8 堿性磷酸酶的活性分析

在6孔板中培養(yǎng)的細胞(1×105/孔)使用含有10% v/v FBS、0.1 μmol/L地塞米松，50 mg/L抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的成骨誘導培養(yǎng)基進行成骨誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后，分析堿性磷酸酶的活性。

圖1 H2O2溶液對骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)的影響。A：對照組；B：100 μmol/L H2O2-2 h組；C：100 μmol/LH2O2-4 h組，倒置相差顯微鏡下的細胞；D：平和松散狀老年細胞在各組中的百分比。*P<0.05，**P<0.01，n=6。

收集上述步驟中的BMSCs后，使用0.05% triton和超聲技術(冰浴，150 W，3 s間隔)進行細胞裂解。然后，根據(jù)試劑盒(南京建成科技有限公司)說明，使用酶標儀(BMG，Labtech，Ortenberg，德國)在405 nm波長處檢測堿性磷酸酶。

1.9 統(tǒng)計學處理

不同組之間通過方差分析進行比較，并且使用SPSS 15軟件進行統(tǒng)計分析。如果方差分析的差異具有統(tǒng)計學意義，應用Bonferroni校正進行成對比較。P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氧化應激對BMSCs形態(tài)的影響

為了驗證氧化應激是否會導致間質(zhì)干細胞的衰老，本研究使用100 μmol/L H2O2溶液對細胞進行處理。分別孵育2 h和4 h后，將細胞培養(yǎng)24 h，然后在倒置顯微鏡下進行形態(tài)學觀察。結果顯示，對照組的BMSCs表現(xiàn)為規(guī)則的梭形(圖1 A)，而用H2O2溶液處理的BMSCs中，尤其是用H2O2溶液處理4 h的BMSCs中，扁平狀、分布稀疏的老年細胞數(shù)量顯著增加(圖1B、1C，P<0.05)。與對照組相比，扁平狀、分布稀疏的BMSCs在所有細胞中的比例在用H2O2溶液處理2 h后可增加到57.85%，表明氧化應激可加速BMSCs的衰老(圖1D)。

2.2 氧化應激導致BMSCs快速衰老，增殖減少，端粒長度縮短，堿性磷酸酶活性降低

圖2 H2O2溶液對骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老、增殖、端粒長度及堿性磷酸酶活性的影響。A：β-半乳糖苷酶染色；B：β-半乳糖苷酶染色陽性細胞的百分比；C：細胞增殖CCK-8檢測；D：端粒長度檢測；E：細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性。*P<0.05，**P<0.01，n=6。

β-半乳糖苷酶染色是檢測細胞衰老的經(jīng)典方法。用H2O2溶液處理BMSCs后，BMSCs在β-半乳糖苷酶染色陽性率明顯增加。細胞核周圍有天藍色顆粒(圖2 A、2B，P<0.05)。這代表了β-半乳糖苷酶染色的陽性結果。CCK-8分析顯示，H2O2溶液處理后，BMSCs的增殖減少，OD值低于對照組(圖2C)，其中100 μmol/L H2O2-2H組和100 μmol/L H2O2-4H組分別為對照組的87.17%和63.17%。在100 μmol/L H2O2-4H組中，端粒長度比對照組縮短約16%(圖2D，P<0.05)；在細胞分化方面，BMSCs中堿性磷酸酶活性顯著降低(圖2E，P<0.05)，表明氧化應激不僅加速了細胞的衰老，而且降低了成骨分化能力。

2.3 過度傳代導致BMSCs快速衰老，增殖減少，端粒長度縮短，堿性磷酸酶活性降低

隨著傳代次數(shù)的增加，β-半乳糖苷酶染色的BMSCs陽性率隨著傳代次數(shù)的增加而增加。 P8組和P16組BMSCs的陽性率分別比P2組提高了21.2%和35%(圖3 A、3B，P<0.05)。 細胞的增殖能力也隨傳代次數(shù)增多出現(xiàn)減弱。P8組和P16組BMSCs增殖能力顯著下降(圖3C)。 P16組BMSCs的端粒長度比P2組縮短約9%(圖3D，P<0.05)，但P8組、P4組和P2組的端粒長度比較沒有顯著縮短。與用H2O2溶液處理的細胞類似，P16組BMSCs的堿性磷酸酶活性也顯著降低(圖3E，P<0.05)，表明細胞的成骨分化能力隨著傳代數(shù)量的增加而減弱。

2.4 抑制端粒長度縮短可緩解氧化應激引起的細胞衰老和分化能力下降

本研究發(fā)現(xiàn)Olaparib可降低由H2O2溶液引起的β-半乳糖苷酶染色陽性率的增加(圖4 A，P<0.05)，表明Olaparib可緩解BMSCs的衰老，并增強其增殖能力(圖4B，P<0.05)。為了證實端粒長度對細胞衰老和細胞分化能力的影響，本研究使用PARP1抑制劑Olaparib激活ATM激酶以抑制端粒長度的縮短。與單獨使用H2O2溶液4 h相比，Olaparib+H2O2溶液可顯著抑制端粒長度的縮短(圖4C，P<0.05)。堿性磷酸酶的活性測定顯示，應用Olaparib組可以增加H2O2溶液導致降低的堿性磷酸酶活性，增強細胞成骨分化能力(圖4D，P<0.05)。

3 討論

本研究通過觀察細胞形態(tài)、β-半乳糖苷酶染色和細胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，H2O2溶液引起的氧化應激可以加速BMSCs的衰老。氧化應激一直是誘導細胞衰老的常用模型，并且已經(jīng)證實用H2O2溶液處理軟骨細胞和成纖維細胞可以誘導衰老[12]，這表明BMSCs的衰老與體細胞一樣可以由氧化應激引發(fā)。然而，H2O2處理后的BMSCs仍能增殖，這與軟骨細胞增殖停滯不同。此外，BMSCs的衰老誘導需要使用100 μmol/L H2O2處理4 h，而軟骨細胞僅需要2 h的處理便出現(xiàn)顯著衰老，這表明對氧化應激，BMSCs顯示出比體細胞更好的耐受性。

圖3 不同代次的BMSCs衰老程度、增殖能力、端粒長度和堿性磷酸酶活性比較。A：β-半乳糖苷酶染色；B：β-半乳糖苷酶染色中陽性細胞的百分比；C：由CCK-8檢測到的細胞增殖；D：檢測端粒長度；E：細胞中堿性磷酸酶的活性。*P<0.05，**P<0.01，n=6。

圖4 端粒長度短縮后BMSCs的衰老、增殖、端粒長度和堿性磷酸酶活性受到抑制。A：β-半乳糖苷酶染色陽性的百分比；B：細胞增殖CCK-8檢測；C：端粒長度檢測；D：細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性。*P<0.05，**P<0.01，n=6。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)細胞傳代次數(shù)的增加可以引起B(yǎng)MSCs的衰老、增殖能力降低、端粒長度縮短和成骨分化下降。與H2O2的作用機理類似，在細胞體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)箱中高濃度的氧氣可引起細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累，激活應激信號通路，從而通過氧化應激導致細胞衰老[13]。因此，為了抑制或延緩體外培養(yǎng)細胞的衰老，應該在培養(yǎng)箱中保持低濃度的O2[14]或加入抗氧化劑[15]。端粒長度與細胞衰老相關，而氧化應激可以改變端粒末端長度。以往研究表明，氧化應激可以促進軟骨細胞和成纖維細胞中端粒的縮短[12]，本研究發(fā)現(xiàn)氧化應激在BMSCs中也起到相似的作用。然而，一些研究報道稱H2O2的短期刺激不能引起成纖維細胞端粒長度縮短[16]，表明端粒長度縮短是在染色體復制中逐漸誘導出現(xiàn)的。因此，為了消除過度短時間培養(yǎng)的影響，本研究安排了使用H2O2刺激細胞后培養(yǎng)兩周后對端粒長度進行分析。通常認為，由氧化應激引起的DNA破裂是介導端?？s短的作用機制，其中端粒中的重復片段比非重復片段更易受到氧化應激的攻擊。例如，由于ROS的攻擊，GGG的重復序列經(jīng)常發(fā)生破裂[17]。DNA雙鏈斷裂可以同時阻止細胞增殖并促進自我修復系統(tǒng)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著細胞衰老的進展，細胞增殖能力逐漸減弱。由于單鏈斷裂修復的效率相對較低，而DNA中單鏈斷裂可能導致端?？s短[18]。Saeed等[19]發(fā)現(xiàn)端粒酶是維持端粒長度和端粒消耗的關鍵因素，端粒酶基因缺失可導致BMSCs成骨分化功能紊亂，導致細胞衰老。一種PARP1的強抑制劑Olaparib可以促進ATM激酶的活化，進而維持端粒長度[11]。本研究選擇了Olaparib進行干預，來抑制BMSCs中端粒長度的縮短。發(fā)現(xiàn)Olaparib不僅可以抑制細胞的衰老，還可以增強細胞增殖和成骨分化，可作為端粒對BMSCs衰老和細胞功能影響的充分證據(jù)。Olaparib主要通過增加ATM激酶的活性來維持端粒的長度。在哺乳動物細胞中，活化的ATM激酶可以通過促進端粒相關蛋白TRF1的磷酸化來激活端粒體的功能，從而維持端粒的長度[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，由H2O2或過量傳代引起的細胞衰老可能導致堿性磷酸酶(成骨分化的標志物)的活性降低，并且通過抑制端粒長度的縮短延緩衰老可以部分地反轉(zhuǎn)堿性磷酸酶活動的降低。在筆者以前的實驗中還發(fā)現(xiàn)，隨著供體年齡的增加，BMSCs的成骨分化能力下降，這與本研究的結果一致[21]。隨著年齡的增加，BMSCs的質(zhì)量和數(shù)量的下降也被證實[22]。因此，分析干細胞的增殖及成骨能力下降與端粒短縮有相關性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)氧化應激和傳代次數(shù)的增加可以引起B(yǎng)MSCs的端粒短縮，進一步導致干細胞衰老、成骨分化能力降低。因此，抑制端?？s短不僅可以減少BMSCs衰老，促進干細胞增殖，還可以增加BMSCs的成骨分化能力，為骨質(zhì)疏松等衰老性疾病提供新的治療方向。