楊依然 劉鐘 王均華 劉康 史曉林*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種系統(tǒng)性多因素骨骼疾病，其主要特征是骨量低，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，骨脆性增加，繼發(fā)骨折，并導(dǎo)致終身殘疾或死亡[1]。成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收共同組成的骨重建過程貫穿著生命體的始終，骨吸收大于骨形成而造成骨量減少的根源是由骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的細(xì)胞水平?jīng)Q定的[2]。CKIP-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，是重要的成骨負(fù)調(diào)節(jié)因子[3]。CKIP-1沉默對體內(nèi)、體外大鼠成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和成骨分化都有明顯的促進作用[4]，但是CKIP-1對體外破骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖的影響至今尚且存在一定爭議，相關(guān)報道也較少。尹秀山等[5]在建立CKIP-1基因敲除大鼠模型的過程中，誘導(dǎo)大鼠脾臟和骨髓中的單核/巨噬細(xì)胞細(xì)胞前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，進行相關(guān)檢測發(fā)現(xiàn)CKIP-1可能不影響破骨細(xì)胞的功能。但在CKIP-1缺失情況下，骨髓中誘導(dǎo)出的破骨細(xì)胞數(shù)量比脾臟中誘導(dǎo)出的多，這提示CKIP-1可能對破骨細(xì)胞的增殖有影響。本研究取大鼠四肢長骨分離、培養(yǎng)破骨細(xì)胞，構(gòu)建CKIP-1過表達(dá)慢病毒，通過觀察CKIP-1過表達(dá)慢病毒感染的體外大鼠破骨細(xì)胞的增殖情況，探討CKIP-1對體外大鼠破骨細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗試劑：DMEM培養(yǎng)基(Lifetechnologies，31966)，胎牛血清(Lifetechnologies，10099)，Antibiotic-Antimycotic(Lifetechnologies，15240-112)，PBS緩沖液(pH7.4)(Lifetechnologies，10010-049)，Trypsin-EDTA(0.05%)(Lifetechnologies，25300-054)，Lipofectamine & REG；2000 Transfection Reagent(Lifetechnologies，11668-019)，Opti-MEM & REG；I Reduced Serum Medium(Lifetechnologies，31985-062)，PureLink RNA Mini Kit(Ambion)，SuperScript & TRADE；III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(Invitrogen)，SYBR GreenER&TRADE；qPCR SuperMix Universal(Invitrogen)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，D001-2)，TRAP染色試劑盒(sigma-aldrich，NO387)，TRIZOL(全式金，H10318)，RNA溶解液(全式金，H10323)，DEPC(Amresco，E174)，氯仿(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，10006818)，CCK8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，C0037)，抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0332)。

1.1.2實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo，Thermo 3111)，超凈工作臺(蘇信，YJ-840/YJ-1340)，MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate(ABI)，熒光定量PCR儀(Agilent，Stratagene MX3005p)，分光光度計(Beckman，DU730)顯微鏡(奧林巴斯，CX23)移液器(Eppendorff)，生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51)，臺式低速離心機(上海貝恩生物科技有限公司，TDZ4B-WS)，振蕩器(上海滬西分析儀器廠，WH-2)，離心機(Eppendorf，centrifuge 5415R)，PCR儀(Eppendorf，5333 53658)，低溫冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TG-16 M)，酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃酶標(biāo)儀，MK3)，移液槍(吉爾森P型移液器公司)，生化自動分析儀(Olympus Au 800)。

1.1.3實驗動物：新生2 d齡SD乳大鼠5只。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠原代破骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定：取2 d齡SD乳大鼠5只，無菌取四肢長骨，放入含青、鏈霉素的冷D-Hank’s平衡鹽溶液中，小心剝離肌肉組織，將軟組織去除干凈，洗2～3次，并將干骺段剪去，然后將骨置于5 mL含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，先橫向剪成4～5 mm長的骨段，再縱向剪開暴露骨干內(nèi)側(cè)，用吸管反復(fù)吹打5～10 min。使貼附在骨基質(zhì)上的破骨細(xì)胞脫落下來，收集含骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)液，于35 mm培養(yǎng)皿中靜置10 min，收集未貼壁的細(xì)胞懸液過200目細(xì)胞篩，以1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，所得白色沉淀物即為制得的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞團。用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打均勻，將細(xì)胞懸液通過200目細(xì)胞篩。去除可能存在韻非破骨細(xì)胞和雜質(zhì)成分。然后將濾過后的細(xì)懸液調(diào)成1×106/mL濃度，吹打均勻后，接種到培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。12 h后換液，以去除紅細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞，每2日換液1次，生物倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并照相，抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒進行檢測。

1.2.2病毒載體的構(gòu)建和鑒定：(1)病毒載體的構(gòu)建。合成美國國立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)中CKIP-1基因cDNA序列，結(jié)合酶切位點，構(gòu)建至帶GFP的過表達(dá)載體中。合成兩端帶有BamH I和Xho I酶切位點的上述序列，連接至pReceiver-Lv201載體。連接至pReceiver-Lv201載體，構(gòu)建過表達(dá)載體pReceiver-Lv201-CKIP-1。(2)病毒載體的鑒定。照試劑說明書提取總RNA，總RNA抽提產(chǎn)物用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系：SYBRGreenERqPCR SuperMix Universal：12.5 μL；Forward primer(10 μmol/L)：0.5 μL；Reverse primer(10 μmol/L)：0.5 μL；cDNA：0.5 μL；DEPC-treated water：11 μL。PCR擴增條件：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；40 cycles；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s。按照儀器使用說明進行qPCR實驗，收集數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。

1.2.3慢病毒包裝：(1)慢病毒構(gòu)建。將293T細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2，飽和濕度環(huán)境。用胰酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.2 ×107細(xì)胞/20 mL，重新接種于15 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。滅菌離心管中加入適量的目的基因載體以及病毒骨架載體，用Opti-MEM 混合均勻，調(diào)整總體積為2.5 mL，在室溫下溫育5 min。將Lipofectamine 2000 試劑輕柔搖勻，取100 μL與2.4 mL Opti-MEM 混合，在室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA不稀釋后的Lipofectamine 2000 進行混合，并在室溫下溫育20 min后將該混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，更換為含有10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。(2)慢病毒濃縮。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液。于4 ℃，4 000 g 離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到0.45 μm超濾管中。過濾除去細(xì)胞碎片。以上清液于40 mL超速離心管中。4 000 g 離心15 min，濃縮病毒。將過濾管倒扣在樣品收集管上，1 000 g離心2 min。將病毒濃縮液從樣品收集管移出，分裝后保存在病毒管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實驗分組：將破骨細(xì)胞分為3組。A組：破骨細(xì)胞空白對照組；B組：破骨細(xì)胞+空載病毒組；C組：破骨細(xì)胞+CKIP-1過表達(dá)病毒組。取細(xì)胞經(jīng)PBS緩沖液清洗3次后用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，待細(xì)胞解離后，用細(xì)胞培養(yǎng)基5 mL終止消化，吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿底解離下來，然后放入15 mL離心管中，1 500 rpm離心5 min，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，然后按照1×105/孔細(xì)胞的數(shù)量，種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)。次日，待細(xì)胞貼壁生長后，進行分組及對應(yīng)處理。

1.2.5qRT-PCR檢測：病毒感染48 h后，取以上處理后的細(xì)胞于無RNA酶的EP管中，加裂解液進行裂解；加入1 mL的Trizol，移入無RNA酶的EP管中，劇烈震蕩5 min；加入氯仿200 μL，震蕩直至乳化，再室溫靜置5 min。12 000 g 4 ℃離心15 min，從離心機中取出離心管，此時裂解液分為3層：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取無色上清液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5 mL離心管中；經(jīng)過異丙醇沉淀，乙醇清洗，沉淀溶解完成樣本處理。

將RNA在65 ℃條件下水浴5 min后，立即置于冰上冷卻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min；85 ℃ 5 min；4 ℃ 5 min；置于-20 ℃保存。反應(yīng)體系(25 μL)：RNA-Primer Mix：12 μL，5×RT Reaction Buffer：5 μL，25 mmol/L dNTPs：1 μL，25 U/μL RNase Inhibitor：1 μL，200 U/μL M-MLV Rtase：1 μL，Oligo(dT)18∶1 μL，ddH2O(DNase-free)：4 μL。

采用兩步法進行Real-time PCR。體系：Primer P1∶0.4 μL，Primer P2∶0.4 μL，2×supermix：10 μL，PASSIVE DYE：0.4 μL，Template：2 μL，ddH2O：6.8 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。溶解曲線：95℃15 s，60 ℃ 15 s，20 min升溫，95 ℃ 15 s。使用的引物序列：CKIP-F CGATCCCGCCATGAAGAAGA，CKIP-R TCAGCACCACATAGCGGTTT。

1.2.6CCK-8檢驗：在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μL/孔)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時間(37 ℃，5% CO2)。待細(xì)胞完全貼壁后進行以上分組處理。向每孔加入10 μL CCK-8反應(yīng)液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠原代破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色鑒定結(jié)果

由圖1可見，破骨細(xì)胞體積大，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核大小數(shù)目不一，呈圓形或橢圓形且排列無規(guī)則?？咕剖崴嵝粤姿崦溉旧b定顯示分離獲得的破骨細(xì)胞陽性率為(95.20±3.69)%。

圖1 大鼠原代破骨細(xì)胞TRAP染色結(jié)果(圖中比例尺為50 μm)

2.2 qRT-PCR檢測破骨細(xì)胞中CKIP-1表達(dá)水平

由圖2可見，在體外大鼠破骨細(xì)胞，A組和B組的CKIP-1基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與A組和B組相比，感染CKIP-1過表達(dá)慢病毒的C組，CKIP-1基因表達(dá)水平明顯顯著提高(P<0.01)，這表明CKIP-1過表達(dá)慢病毒構(gòu)建及感染體外大鼠破骨細(xì)胞均成功。

圖2 qRT-PCR檢測破骨細(xì)胞中CKIP-1的mRNA水平(**P<0.01)

2.3 CKIP-1過表達(dá)對破骨細(xì)胞增殖的影響(ckk-8檢測)

圖3結(jié)果顯示，在破骨細(xì)胞中，A組和B組的細(xì)胞增殖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。相比A組和B組，感染CKIP-1過表達(dá)病毒的C組的細(xì)胞增殖比例顯著增高(P<0.01)，這表明在來自四肢長骨的體外大鼠破骨細(xì)胞，CKIP-1過表達(dá)可以明顯提高破骨細(xì)胞的增殖能力。

圖3 CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖情況(**P<0.01)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種與增齡相關(guān)的骨骼疾病，隨著人口老齡化的不斷擴大，骨質(zhì)疏松癥已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題[6]，因此對骨平衡的生理調(diào)控機制和骨流失的病理機制的研究，和可能由此產(chǎn)生的新治療策略變得非常重要[7]。CKIP-1作為重要的骨形成負(fù)調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)是對于OP治療的有希望的靶標(biāo)。Zhang等[8]使用去卵巢大鼠模型評估骨靶向遞送系統(tǒng)(DSS 6-脂質(zhì)體)遞送的CKIP-1 siRNA的功效發(fā)現(xiàn)，治療性CKIP-1siRNA干預(yù)可顯著促進骨形成而不影響骨吸收。隨后又有研究證明敲除CKIP-1基因可以抵消微重力造成的骨質(zhì)疏松癥[9]。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞靶向CKIP-1 siRNA治療可以減弱糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨形成減少。

因為破骨細(xì)胞本身生命周期較短的原因，針對CKIP-1對破骨細(xì)胞影響的研究相對少很多。但是CKIP-1可以通過抑制TRAF6(TNF receptor associated factor 6)介導(dǎo)的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)激活而在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[11]，而單核/巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞關(guān)系密切[12-13]。還有較新的研究證明破骨細(xì)胞增殖過程中出現(xiàn)的一種受體互動蛋白和成骨細(xì)胞的分化存在一定關(guān)系[14]，這對CKIP-1對破骨細(xì)胞的增殖影響機制的研究有一定提示意義。但也有文獻報道，在敲入表達(dá)E3連接酶失活的TRAF6突變體的小鼠原代巨噬細(xì)胞和野生型細(xì)胞中，RANKL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞信號傳導(dǎo)和骨髓向破骨細(xì)胞的分化相似[15]。

4 結(jié)論

本研究成功分離培養(yǎng)出大鼠四肢長骨來源的破骨細(xì)胞，CKIP-1過表達(dá)慢病毒構(gòu)建并感染體外大鼠破骨細(xì)胞成功，CKIP-1的過表達(dá)具有促進四肢長骨來源的體外大鼠破骨細(xì)胞增殖的能力。