李鑫玲，張慧蕓， 康懷彬*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng),471023) 2(食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽(yáng),471023)

近年來(lái)，調(diào)理(ready-to-cook, RTC)肉制品因其方便和新鮮廣受歡迎，但因其蛋白、脂肪含量豐富，在加工和銷(xiāo)售過(guò)程中容易被氧化導(dǎo)致酸敗、褪色，同時(shí)脂類(lèi)和蛋白質(zhì)發(fā)生降解、蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響肉品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官品質(zhì)[1]。因此，如何提高調(diào)理肉制品的貨架期成為調(diào)理肉制品保鮮領(lǐng)域的一個(gè)新的課題。

隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，天然涂膜保鮮劑迅速成為保鮮領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，并取得了一定的成果。殼聚糖是僅次于纖維素的第二大多糖，由于其生物相容性、抗菌活性和良好的成膜性等特性，被廣泛用于肉類(lèi)保鮮的研究[2-3]。MOHAN等[4]指出，與對(duì)照樣品相比，殼聚糖涂膜可延長(zhǎng)沙丁魚(yú)保質(zhì)期 3～5 d。然而，也有報(bào)道指出殼聚糖膜對(duì)肉品的抗氧化作用有限[5-6]，將其與天然抗菌劑結(jié)合使用是解決這一問(wèn)題的有效方法。丁香精油是從丁香樹(shù)的花蕾、葉子等提取的芳香精油，為美國(guó)食品和藥物管理局普遍認(rèn)可的食品添加劑；其主成分為丁香酚、β-丁香烯、乙酰丁香酚等[7]，具有良好的抗氧化和抗菌活性[8-9]。雖然丁香精油作為天然保鮮劑應(yīng)用已被報(bào)道，但可食性涂膜保鮮液對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間品質(zhì)的影響研究甚少，考慮二者的協(xié)同作用，本研究采用殼聚糖及丁香精油對(duì)調(diào)理豬排進(jìn)行涂膜保鮮，研究其對(duì)調(diào)理豬排4 ℃冷藏期間菌落總數(shù)、脂肪氧化、蛋白氧化及色差的影響，并采用拉曼光譜研究了調(diào)理豬排冷藏過(guò)程中蛋白結(jié)構(gòu)的變化，為可食性涂膜保鮮劑開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長(zhǎng)肌，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻校粴ぞ厶?脫乙酰度95%),上海藍(lán)季生物試劑有限公司；丁香精油(丁香酚含量>90%)、丁基羥基茴香醚(BHA)，國(guó)藥集團(tuán)；三氯乙酸(分析純)、硫代巴比妥酸、DNPH、乙酸乙酯、鹽酸胍、DNTB，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H2050R臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；UV-2800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司； AD500S-H數(shù)顯分散均質(zhì)機(jī)，上海昂尼儀器儀表有限公司；CR400色差分析儀，日本KONICA MINOLTA公司；XPLORA ONE 785nm激光拉曼光譜儀，法國(guó)HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 肉樣的處理

超市采購(gòu)豫南黑豬第12腰椎處背最長(zhǎng)肌(屠宰后 2 h 內(nèi))，4 ℃條件下轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)修整去除脂肪、筋、膜，切為50 mm×50 mm×10 mm(約50～80 g)的片，添加1.5%食鹽、150 mg/kg焦磷酸鈉、75mg/kg六偏磷酸鈉和三聚磷酸鈉、0.4%黑胡椒腌制24 h。殼聚糖保鮮液配制：用1 g/L的冰醋酸溶液將殼聚糖液解并定容，配制為2 g/L的殼聚糖溶液；精油添加量為豬排總質(zhì)量的0.2%。

腌制過(guò)后分為對(duì)照組(未涂膜處理)、殼聚糖涂膜組(Ch)及殼聚糖+丁香精油涂膜組(Ch+Clo)，15份每組，分別將殼聚糖溶液和丁香精油均勻涂抹在剔除筋膜及表皮的豬排上，每個(gè)樣本單獨(dú)放置在一個(gè)密封的聚乙烯袋，在冰箱(4±1)℃保存13 d。根據(jù)預(yù)定的時(shí)間間隔，分別在1、4、7、10、13 d時(shí)隨機(jī)抽取每個(gè)組的樣本進(jìn)行分析。

1.3.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

依據(jù) GB 4789.2—2016《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)：菌落總數(shù)測(cè)定》。對(duì)照肉質(zhì)量衛(wèi)生指標(biāo)菌落總數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的一般建議標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行：新鮮肉 1～104 CFU/g，次鮮肉 104～106 CFU/g，變質(zhì)肉 106 CFU/g以上。

1.3.3 TBARS 值的測(cè)定

參考 FAUSTMAN等[10]的方法，稍加修改。精確稱(chēng)取0.3 g攪碎的調(diào)理豬排，加入0.3 mL BHA，然后加入3 mL TBA渦旋振蕩，移取TCA-HCL溶液17 mL，沸水浴30 min(反應(yīng))，室溫冷卻，將10 mL上述溶液與10 mL氯仿混合，3 500 r/min條件下離心10 min。取上清液在532 nm處測(cè)定吸光值。TBARS值計(jì)算公式如下：

(1)

式中：A532 nm表示532 nm處樣品的吸光度值；m表示樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 羰基含量的測(cè)定

參考 BOTSOGLOU[11]的方法，略加改進(jìn)。取3 g 肉樣放入30 mL 20 mmol/L pH 6.5 PBS溶液中，5 000 r/min均質(zhì) 20 s。分別取 4 份 0.6 mL均質(zhì)液，加入3 mL 10% TCA，混勻，冰浴 15 min，11 000 r/min，離心 3 min，棄上清液。 再次加入 3 mL 10% TCA，重復(fù)上述步驟。上述樣品中取 2 份加入1.5 mL 10 mmol/L DNPH 溶液，另外2份加入1.5 mL 2.0 mol/L HCl 做空白。在室溫下靜置1 h (每5 min渦旋振蕩1次)，然后加入1.5 mL 20% TCA，冰浴15 min，11 000 r/min，離心3 min，棄上清。沉淀用乙酸乙酯-乙醇(體積比1∶1)洗滌3次，移取3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液溶解蛋白沉淀(37 ℃)，然后冷凍離心10 min(9 500 r/min, 4 ℃ ) 去除不溶物，取上清液在370 nm下測(cè)吸光度。按公式(2)計(jì)算蛋白中羰基含量。

(2)

式中：A，吸光度；ε，摩爾吸光系數(shù)22 000，L/(mol·cm) ；Cpro，蛋白濃度，mg/mL。

1.3.5 總巰基測(cè)定

參考VOSSEN等[13]的方法，并略加改進(jìn)。取1 g調(diào)理豬排肉糜，加入20 mL 0.05 mol /L PBS，均質(zhì)20 s(5 000 r/min)。量取 1 mL 均質(zhì)液加入9 mL 0.05 mol/L PBS混勻，14 000 r/min，4 ℃，離心15 min。然后取上清液3 mL，加入0. 04 mL 0.01 mol/L DTNB，混勻，40 ℃培養(yǎng)15 min?？瞻讓?duì)照用0.05 mol/L PBS代替均質(zhì)液，在412 nm處測(cè)定其吸光度。使用分子吸光系數(shù)13 600 L/(mol·cm) 計(jì)算蛋白中總巰基的含量。

(3)

式中：A，吸光度；V，樣品體積；ε，摩爾吸光系數(shù)136 000，L/(mol·cm) ；I，光程1；m，肉樣質(zhì)量，g。

1.3.6 肉色測(cè)定

參照HAUTE等[13]的方法，并略作修改。采用CR-400型(Minolta-CR400)色差計(jì)(D 65光源，11 mm直徑測(cè)量范圍 10°視角)測(cè)定肉餅表面的顏色(亮度L*、紅度a*、黃度b*)。

1.3.7 拉曼光譜測(cè)定

參照SHAO等[14]方法，稍作修改。用于拉曼光譜的測(cè)定：激光波長(zhǎng)785 nm，功率100 mW，儀器用單晶珪進(jìn)行頻率校正，動(dòng)波長(zhǎng)掃描，掃描3次，積分時(shí)間60 s，檢測(cè)范圍400～3 600 cm-1，每個(gè)樣品測(cè)試3次。用ALIX[15]的方法計(jì)算蛋白質(zhì)不同二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19軟件進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)，用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排菌落總數(shù)的影響

如圖1所示，在調(diào)理豬排冷藏期間，對(duì)照組和處理組菌落總數(shù)均呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，Ch+Clo處理組細(xì)菌總數(shù)顯著低于(p<0.05)對(duì)照組和Ch處理組；第7天時(shí)，對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)顯著高于Ch處理組(p<0.05)，表明經(jīng)殼聚糖涂膜處理后調(diào)理豬排微生物的生長(zhǎng)受到顯著抑制，殼聚糖對(duì)許多食品腐敗菌和致病菌具有抗菌效果[16]。隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，第7天對(duì)照組菌落總數(shù)達(dá)到5.70 lg CFU/g，第13天達(dá)到7.15 lg CFU/g；而第13天時(shí)Ch處理組和Ch+Clo處理組細(xì)菌總數(shù)分別比對(duì)照組低0.83和1.72個(gè)對(duì)數(shù)值。與對(duì)照組相比，Ch處理可延長(zhǎng)微生物貨架期3 d，Ch+Clo處理可延長(zhǎng)6 d。許多研究表明丁香精油具有抗菌活性[17-18]，對(duì)病原菌和腐敗微生物均有較好的抑制作用[19-20]。本研究表明，采用殼聚糖與丁香精油復(fù)合涂膜保鮮調(diào)理豬排，有效抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，抗菌效果明顯。

圖1 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of chitosan and essential oils coating onthe standard plate count of RTC pork chops refrigeratedstorage

2.2 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排TBARS值的影響

殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間TBARS值的影響見(jiàn)圖2。

圖2 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間TBARS值的影響Fig.2 Effects of chitosan and essential oils coating onthe TBARS of RTC pork chops during refrigerated storage

各處理組的TBARS值在第1天無(wú)顯著差異(p>0.05)；所有組的TBARS值持續(xù)增加，13 d達(dá)到最高(p<0.05)。與對(duì)照組相比，Ch處理組的TBARS值顯著下降(p<0.05)。第7天后，Ch+Clo處理組TBARS值顯著低于對(duì)照組和Ch處理組(p<0.05)；在13 d冷藏期，Ch+Clo處理組的TBARS值最低，對(duì)脂質(zhì)氧化抑制效果最好。這些結(jié)果表明，調(diào)理豬排采用Ch+Clo復(fù)合涂膜處理對(duì)延緩脂質(zhì)氧化有積極作用。MOHAN等[4]報(bào)道，在4℃冷藏期間殼聚糖涂膜降低了沙丁魚(yú)的TBARS值；此外，OSKOUEIAN等[21]報(bào)道，丁香精會(huì)阻礙羅非魚(yú)過(guò)氧化值和TBARS值的增加。WAN等[22]將殼聚糖+姜精油處理與對(duì)照組和殼聚糖處理組的冷卻豬肉相比，在不影響顏色和氣味的情況下，二者能協(xié)同降低TBARS值和微生物數(shù)量。這些發(fā)現(xiàn)與本研究的結(jié)果一致，表明殼聚糖與丁香精油復(fù)合涂膜可以作為一種天然抗氧化劑來(lái)改善肉制品的貯藏穩(wěn)定性。

2.3 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排羰基含量的影響

殼聚糖-丁香精油復(fù)合涂膜對(duì)調(diào)理豬排羰基含量的影響見(jiàn)圖3。隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)， Ch+Clo處理組蛋白質(zhì)羰基含量顯著(p<0.05)低于對(duì)照組和Ch處理組；在第7天后， Ch處理組蛋白質(zhì)羰基含量顯著(p<0.05)低于對(duì)照組，表明殼聚糖涂膜具有抑制蛋白氧化的能力，這與殼聚糖可螯合從肌肉血紅蛋白中釋放出來(lái)的鐵離子有關(guān)[23]。丁香精油對(duì)蛋白氧化抑制作用是由于其中的主要成分丁香酚類(lèi)[24]，MAQSOOD等人[25-26]發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)化合物主要通過(guò)螯合金屬離子、清除自由基、阻止脂質(zhì)氧化，并與蛋白質(zhì)結(jié)合形成共價(jià)化合物，從而阻止蛋白質(zhì)羰基的形成，抑制蛋白質(zhì)氧化。

圖3 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間羰基含量的影響Fig.3 Effects of chitosan and essential oils coating on theprotein carbonyl compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

2.4 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排巰基含量的影響

蛋白質(zhì)氧化會(huì)造成巰基含量的減少，巰基容易被自由基攻擊氧化形成二硫鍵，故巰基含量的變化是反應(yīng)蛋白氧化程度的另一個(gè)重要指標(biāo)[27]。如圖4所示，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和處理組的蛋白質(zhì)巰基含量均顯著降低(p<0.05)；Ch處理組和Ch+Clo 處理組蛋白質(zhì)巰基含量顯著高于(p<0.05)對(duì)照組；Ch+Clo 處理組巰基含量顯著高于Ch處理組。NIETO等[28]報(bào)道，將牛至油和迷迭香精油添加到生豬肉餅中，明顯地延緩了巰基的損失；YU等[29]研究指出與殼聚糖涂膜相比，殼聚糖與丁香精油復(fù)合涂膜對(duì)草魚(yú)片有更好的抗氧化效果，與本研究結(jié)果一致。

圖4 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間巰基含量的影響Fig.4 Effects of chitosan and essential oils coating on theprotein sulphydryls compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

2.5 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排肉色的影響

殼聚糖與丁香精油復(fù)合涂膜對(duì)調(diào)理豬排肉色的影響見(jiàn)表1。

表1 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排在貯藏過(guò)程中肉色的影響Table 1 Effects of chitosan and essential oils coating on thecolor characteristics of RTC pork chops during refrigeratedstorage

注：同一列肩標(biāo)字母(a～e)不同，表示同一處理下，不同冷藏時(shí)間差異顯著(p<0.05)；同一行肩標(biāo)字母(A～C)不同，表示同一冷藏時(shí)間下，不同處理差異顯著(p<0.05)。

如表1所示，在第1天時(shí)，對(duì)照組及處理組a*值無(wú)顯著差異(p>0.05)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組的a*值顯著降低(p<0.05)，與對(duì)照組相比，Ch處理組和Ch+Clo處理組顯著抑制a*值(p<0.05)的降低，且在冷藏過(guò)程中保持穩(wěn)定。由此可以看出，在4 ℃冷藏條件下，Ch處理組和Ch+Clo處理組對(duì)調(diào)理豬排有一定的護(hù)色作用，抑制了調(diào)理豬排顏色的劣變。KONG等[30]研究表明，與對(duì)照組相比，添加丁香提取物顯著抑制了豬肉餅冷藏期間a*值的降低(p<0.05)。

隨著貯藏期的延長(zhǎng)，調(diào)理豬排的L*值和b*值均呈逐漸趨勢(shì)，但同對(duì)照組相比，經(jīng)Ch和Ch+Clo涂膜處理后，調(diào)理豬排的L*值和b*值的增加均不同程度地受到抑制。一些研究指出，肉制品中的脂肪氧化導(dǎo)致了肉顏色的劣變[31]；同時(shí)a*值的下降和b*值的升高與脂肪氧化是相關(guān)的[32]。FALOWO等[33]報(bào)道，天然植物提取物對(duì)肉制品的護(hù)色作用歸因于酚類(lèi)化合物的抗氧化能力。酚類(lèi)化合物對(duì)肉制品脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的抑制作用已被廣泛報(bào)道[34-35]，因此，殼聚糖-丁香精油復(fù)合涂膜對(duì)調(diào)理豬排護(hù)色作用可能是由于其中含有的丁香酚類(lèi)化合物所致。

2.6 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

本研究采用拉曼光譜檢測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)的變化，拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是直接、無(wú)損，固體或液體食品可以根據(jù)其拉曼光譜的峰位、強(qiáng)度及位移的變化反應(yīng)食品內(nèi)部蛋白的結(jié)構(gòu)變化[36]。

圖5 調(diào)理豬排樣本的拉曼光譜Fig.5 Raman spectrum of a RTC pork sample

圖6 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間α-螺旋含量的影響Fig.6 Effects of chitosan and essential oils coating onthe protein α-helix compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

圖7 殼聚糖與丁香精油涂膜對(duì)調(diào)理豬排冷藏期間β-折疊含量的影響Fig.7 Effects of chitosan and essential oils coating onthe protein β-sheet compounds of RTC pork chops duringrefrigerated storage

由圖6和圖7可知，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組調(diào)理豬排蛋白質(zhì) α-螺旋含量顯著降低(p<0.05)，而β-折疊含量顯著増加(p<0.05)，酰胺Ⅰ帶向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，表明在冷藏過(guò)程中，蛋白中的α-螺旋逐漸解折疊展開(kāi)，轉(zhuǎn)化為 β-折疊結(jié)構(gòu)，多肽鏈在空間的走向發(fā)生重排；其中，Ch+Clo 處理組α-螺旋含量最高，而 β-折疊含量最低，與對(duì)照組和 Ch 處理組相比差異顯著(p<0.05)，表明 Ch 膜和 Ch+Clo復(fù)合膜均可抑制調(diào)理豬排蛋白中的 α-螺旋向 β-折疊轉(zhuǎn)化，且Ch+Clo處理組抑制效果明顯；這進(jìn)一步證實(shí)了蛋白氧化理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，隨著蛋白氧化，促進(jìn)巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化，疏水性增大，羰基值增加。BERHE等[42]對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，加熱溫度與蛋白氧化程度呈正相關(guān)越強(qiáng)，同時(shí)隨著氧化的進(jìn)行，酰胺Ⅰ帶沿長(zhǎng)波方向移動(dòng)，與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

采用殼聚糖及殼聚糖與丁香精油復(fù)合涂膜作為涂膜保鮮劑對(duì)調(diào)理豬排進(jìn)行保鮮，考察其對(duì)冷藏期間調(diào)理豬排品質(zhì)的影響，并采用拉曼光譜研究了調(diào)理豬排冷藏期間蛋白結(jié)構(gòu)的變化。通過(guò)研究表明，經(jīng)殼聚糖涂膜處理的調(diào)理豬排在冷藏過(guò)程中菌落總數(shù)、脂質(zhì)及蛋白氧化得到有效抑制，具有良好的保鮮效果；殼聚糖與丁香精油復(fù)合后顯著提高了殼聚糖涂膜的抗菌和抗氧化作用，明顯提高了調(diào)理豬排冷藏期間的品質(zhì)和貨架期，具備作為天然可食性涂抹保鮮劑應(yīng)用于食品尤其是調(diào)理肉制品中的潛力。