王佳 ，陶曉奇，2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

磺胺類藥物(sulfonamides, SAs)是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，具有廣譜抗菌活性。它能抑制細(xì)菌葉酸代謝，干擾細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)的合成，從而對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及一些原生生物具有抑制作用[1]，且使用方便、價(jià)格便宜。因此該類藥物被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療。

SAs主要在雞、魚、豬肉、牛奶、蜂蜜和雞蛋等動(dòng)物性食品中存在部分殘留[2]。若長(zhǎng)期食用含有該類藥物的食物，會(huì)導(dǎo)致耐藥性菌株的產(chǎn)生，引起過敏、中毒甚至癌變等癥狀，對(duì)人體健康有很大危害[3]。歐盟、美國(guó)、加拿大規(guī)定動(dòng)物源食品中SAs總量不得超過100 μg/kg[4]，日本規(guī)定不得超過20 μg/kg[5]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告明確規(guī)定：所有動(dòng)物源性食品中，磺胺類藥物總量的最高殘留限量(maximum residue limits, MRL)為100 μg/kg，磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine, SM2)的MRL為25 μg/kg[6]。

目前，動(dòng)物性食品中SAs的檢測(cè)方法有：色譜/質(zhì)譜法[7-9]、毛細(xì)管電泳法[10]、微生物抑制法[11]、免疫分析法[12]、分光光度法[13]等理化方法。本文就近幾年SAs的免疫分析方法進(jìn)行綜述，以期為獸藥殘留的監(jiān)控提供有益參考。

1 抗原

常見的殘留藥物均為小分子化合物(一般分子質(zhì)量小于1 000)，缺乏T細(xì)胞表位而不能直接刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，而將小分子藥物與大分子載體蛋白連接后可直接刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)原小分子藥物的特異性抗體。在免疫學(xué)上，將這種小分子藥物稱為半抗原，因其只具備反應(yīng)原性，不具備免疫原性。將半抗原與載體蛋白連接后形成的大分子物質(zhì)稱為全抗原(結(jié)合抗原)，因其同時(shí)具備反應(yīng)原性和免疫原性。

1.1 免疫半抗原的設(shè)計(jì)

免疫半抗原設(shè)計(jì)的基本原則是半抗原與載體連接后，在全抗原中能最大程度的保持和突出待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)，特別是空間結(jié)構(gòu)。其一般結(jié)構(gòu)包括：待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)、間隔臂以及末端的活性基團(tuán)。一些情況下，待測(cè)物可直接作為半抗原與載體蛋白相連，其間隔臂為待測(cè)物中的非特異性結(jié)構(gòu)；而多數(shù)情況下，需自行構(gòu)建間隔臂，間隔臂的位置應(yīng)遠(yuǎn)離待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)部分和官能團(tuán)，其長(zhǎng)度取4～6碳為宜。間隔臂末端一般連接氨基或羧基作為活性基團(tuán)，這樣可以簡(jiǎn)單地運(yùn)用合成肽的方法通過穩(wěn)定的酰胺鍵將半抗原與載體蛋白相連。SAs半抗原設(shè)計(jì)應(yīng)保留磺胺母核對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)，同時(shí)使半抗原空間結(jié)構(gòu)、疏水性、電荷性質(zhì)與母體分子的相似性最大化[14]。CHEN 等[15]以對(duì)乙酰氨基苯磺酰氯為原料，通過取代反應(yīng)合成了7種不同結(jié)構(gòu)的半抗原，包含五元噻唑環(huán)、六元苯環(huán)、嘧啶環(huán)以及直鏈烷基結(jié)構(gòu)。將其中4種偶聯(lián)牛血清白蛋白作為免疫原，7種均偶聯(lián)卵清蛋白作為包被原，經(jīng)過多次免疫和血清篩選，制備出高親和力的廣譜特異性抗體。

1.2 全抗原的合成

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，免疫原性好，故一般采用蛋白質(zhì)作為載體，常用的載體蛋白有牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、雞卵清蛋白(ovalbumin, OVA)、人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)等。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中供連接的基團(tuán)主要為游離氨基、游離羧基和酚基等，連接方式取決于半抗原活性基團(tuán)種類、溶解度和穩(wěn)定性。含有氨基和羧基的半抗原，可使用肽合成化學(xué)方法在溫和的條件下將半抗原和載體共價(jià)結(jié)合，常用方法有重氮化法，碳二亞胺法和N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法(N-hydroxysuccinimide, NHS)[16]等。含有巰基或羥基的半抗原，可使用雙官能團(tuán)試劑，如琥珀酸酐、鹵代脂肪酸等進(jìn)行處理，生成帶氨基或羧基的化合物后再進(jìn)行連接。WANG等[17]使用EDC/NHS將磺胺半抗原與BSA偶聯(lián)作為免疫原免疫新西蘭白兔，成功制備了可用于檢測(cè)26種磺胺藥物的廣譜特異性多克隆抗體。HOLGER等[18]使用DCC/NHS將磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMX)半抗原偶聯(lián)KLH作為免疫原免疫新西蘭白兔，制備針對(duì)SMX的高親和力和選擇性的多克隆抗體，使用該抗體建立直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，檢測(cè)環(huán)境水樣中的SMX，其定量范圍為0.82～63 μg/L。

2 抗體

抗體是免疫分析中的核心試劑，一般從效價(jià)、親和性和特異性3個(gè)方面來評(píng)價(jià)抗體的性能。抗體的研究歷經(jīng)了多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體3個(gè)階段。目前廣義的新型抗體主要有基因工程抗體、核酸適配體、分子印跡聚合物和受體等[19]。

2.1 多克隆抗體(polyclonal antibody, PcAb)

多克隆抗體是由多個(gè)抗原決定簇刺激機(jī)體產(chǎn)生反應(yīng)，產(chǎn)生的多種單克隆抗體混合在一起構(gòu)成的抗體，因其制備周期短，成本低等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床診斷。WANG 等[17]合成了3種不同免疫原來免疫新西蘭白兔，制備SAs族特異性多克隆抗體，使用該抗體對(duì)26種磺胺藥物進(jìn)行ELISA分析，其IC50(50%結(jié)合時(shí)待測(cè)物濃度)均低于100 ng/mL。

2.2 單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)

單克隆抗體是由單一的B淋巴細(xì)胞分裂增殖而來的細(xì)胞克隆分泌的抗體，針對(duì)某一特定的抗原決定簇或表位，在免疫特性、理化性質(zhì)等方面都是高度均一的?；陔s交瘤技術(shù)，單克隆抗體具有重現(xiàn)性高和無限供應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，因此商業(yè)化免疫檢測(cè)產(chǎn)品多使用單克隆抗體；但其制備周期較長(zhǎng)，一般需要6～12個(gè)月，成本較高。CHEN等[15]針對(duì)磺胺N1位點(diǎn)不同結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了4種不同免疫原，用于免疫Balb/c小鼠，經(jīng)過多次免疫和血清篩選，結(jié)果顯示：含嘧啶環(huán)的半抗原S5免疫后產(chǎn)生的抗血清結(jié)合直鏈烷基結(jié)構(gòu)半抗原S3異源包被時(shí)，對(duì)大多數(shù)磺胺藥物均有抑制，顯示出廣譜特異性，其IC50最低達(dá)0.15 ng/mL。

2.3 基因工程抗體(genetic engineering antibody)

基因工程抗體是將抗體的基因重組并克隆到表達(dá)載體中，在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)并折疊成有功能的一種抗體分子。它增強(qiáng)了天然抗體的特異性等生物學(xué)特性，減少了無關(guān)和產(chǎn)生副作用的結(jié)構(gòu)，如嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、二硫鍵穩(wěn)定抗體、Fab片段、納米抗體、雙特異性抗體等[20]。LI等[21]應(yīng)用基因工程技術(shù)制備了SAs單鏈抗體，通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA得知其仍保留了親本單克隆抗體的識(shí)別特性?；蚬こ炭贵w具有相對(duì)分子質(zhì)量低、親和力高、可塑性強(qiáng)，且形成的抗原抗體復(fù)合物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 核酸適配體(aptamer)

核酸適配體是人工合成的單鏈寡核苷酸(DNA或RNA)，它是從人工構(gòu)建的寡核苷酸文庫中通過體外配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選而來的。核酸適配體的功能與抗體相似，但與抗體相比，其分子量小、合成簡(jiǎn)單、且適用范圍更廣(能高親和力和高特異性結(jié)合藥物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、金屬離子等物質(zhì))[22]。CHEN等[23]基于膠體金-核酸適配體比色法建立了定量檢測(cè)磺胺二甲氧嘧啶的方法。其原理是：隨機(jī)卷曲的單鏈DNA(磺胺二甲氧嘧啶核酸適配體)堿基和金納米粒子間存在靜電吸引作用，因此較容易吸附到金顆粒表面，從而避免了高濃度鹽引起的膠體金聚沉變色的現(xiàn)象；而與待測(cè)物結(jié)合后，折疊的單鏈DNA具有了剛性結(jié)構(gòu)，不易吸附到金顆粒表面。該方法可通過觀察膠體金顏色變化定性待測(cè)物，使用分光光度法比色定量待測(cè)物。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后，其檢測(cè)限為50 μg/L，線性范圍為50～1 000 μg/L。具有線性范圍寬，操作簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

2.5 分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)

分子印跡聚合物是一種新型的分子識(shí)別材料，其識(shí)別機(jī)制與抗體-抗原反應(yīng)類似。它是以模版分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑為原料，在光或熱觸發(fā)下合成的具有與模版分子空間結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)排列相匹配的結(jié)合位點(diǎn)的分子識(shí)別材料。SONG等[24]合成了可同時(shí)識(shí)別8種SAs和8種氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones, FQs)的MIP，結(jié)合固相萃取分離豬肉和雞肉中的藥物，其柱吸附能力和回收均達(dá)到較高水準(zhǔn)。這種材料具有高度的專一性和穩(wěn)定性，被認(rèn)為是較好的生物抗體替代品。

2.6 受體(receptor)

受體學(xué)說認(rèn)為大多數(shù)藥物與細(xì)胞膜上或細(xì)胞膜內(nèi)的某些特定分子結(jié)合，才能發(fā)生效應(yīng)，這些特定的分子被稱為受體。配體受體相互作用是分子識(shí)別的過程，主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水相互作用、范德華力等。梁曉等[25]通過體外擴(kuò)增來源于肺炎雙球菌和大腸桿菌的floP基因序列，表達(dá)純化了來源于肺炎雙球菌R6和大腸桿菌ATCC 25922的二氫葉酸合成酶，并基于該受體蛋白建立了可同時(shí)檢測(cè)牛奶中29種磺胺藥物的微孔板檢測(cè)法，其IC50值為2.95～56.22 μg/L，均低于最高殘留檢測(cè)限。

3 免疫分析方法

近幾年，動(dòng)物性食品中磺胺類藥物的免疫分析方法有大量報(bào)道，主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、熒光免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)、膠體金免疫層析以及生物傳感器等方法，表1為相關(guān)文獻(xiàn)的簡(jiǎn)要概括。

表1 動(dòng)物性食品中磺胺類藥物的免疫分析方法Table 1 Immunoassays for sulfonamides in edible animal foods

3.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定是將酶的高效催化作用和抗原抗體免疫反應(yīng)相結(jié)合，用特定的酶(辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)酶催化底物的顯色程度，對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量測(cè)定[26]。LIANG等[27]優(yōu)化了ELISA檢測(cè)SAs多殘的各種參數(shù)，包括單克隆抗體性能、分析模型、免疫試劑和理化參數(shù)(pH、鹽濃度、洗滌液和溶劑)。優(yōu)化后，使用單抗4D11和包被原BS-BSA，在間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA模型下，可同時(shí)檢測(cè)22種SAs，其IC50低于100 μg/L(0.20～88.11 μg/L)。同時(shí)，使用優(yōu)化后的條件檢測(cè)牛奶中的5種SAs，回收率和變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)分別為89.0～104.6%、11.9～19.1%。

隨著新型抗體的發(fā)展，新材料與傳統(tǒng)方法的結(jié)合使磺胺類藥物的檢測(cè)更加靈敏、高效。PENG 等[28]以SM2為模版分子，使用沉淀聚合法合成了分子印跡聚合物，并以此建立了新型ELISA，采用直接競(jìng)爭(zhēng)模型，測(cè)得標(biāo)曲線性范圍為100～3 200 μg/L，回歸系數(shù)為0.999，線性關(guān)系良好；然后結(jié)合分子印跡固相萃取，測(cè)定了豬肉中的SM2，其檢測(cè)限(limit of detection, LOD)和定量限(limit of quantification, LOQ)分別為6.8、20.4 μg/kg。這是首次將MIP-ELISA和分子印跡固相萃取聯(lián)用來測(cè)定真實(shí)樣本中痕量磺胺藥物，具有創(chuàng)新意義。

ELISA從單組份檢測(cè)發(fā)展到多組分檢測(cè)，具有特異性好、靈敏度高、所需設(shè)備少和適合批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)；但ELISA屬于非均相反應(yīng)，難以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。

3.2 熒光免疫分析法(fluorescent immunoassay, FIA)

3.2.1 熒光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay, FPIA)

熒光偏振免疫分析結(jié)合熒光偏振和免疫競(jìng)爭(zhēng)，通過檢測(cè)熒光標(biāo)記抗原在結(jié)合特異性抗體前后的熒光值變化，來定量小分子物質(zhì)。CHEN等[29]建立了基于重組雙特異性單鏈抗體的熒光偏振免疫分析法，分別以諾氟沙星和SMX為標(biāo)準(zhǔn)，使用不同的有機(jī)熒光染料標(biāo)記異源半抗原作為熒光信號(hào)探針與標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)檢測(cè)牛奶中的19種FQs和13種SAs，可在最大殘留限量水平進(jìn)行準(zhǔn)確有效的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間在15 min內(nèi)。雖然該方法靈敏度低于ELISA，但其創(chuàng)新地在均相反應(yīng)中使用了雙特異性單鏈抗體，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高通量篩選，且操作簡(jiǎn)便。

3.2.2 量子點(diǎn)免疫分析(quantum dots immunoassay, QDIA)

量子點(diǎn)又稱半導(dǎo)體納米粒子，是零維納米材料，其尺寸介于1～10 nm。量子點(diǎn)是一種優(yōu)秀的熒光材料，它具備傳統(tǒng)有機(jī)染料沒有的特性：通過改變量子點(diǎn)的尺寸和組成可實(shí)現(xiàn)對(duì)量子點(diǎn)發(fā)射光譜的調(diào)控，從而得到各種顏色的量子點(diǎn)；其激發(fā)光譜寬，有利于同步檢測(cè)；大的斯托克斯位移(Stokes)和窄且對(duì)稱的發(fā)射光譜，可有效避免光譜重疊，從而達(dá)到區(qū)分不同標(biāo)記物的目的；具有良好的光穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的壽命[30]。自從1998年，Alivisatos和Nie等解決了量子點(diǎn)的生物相容性問題，它已被廣泛用于各種與人們息息相關(guān)的物質(zhì)分析檢測(cè)中。HU等[31]建立了量子點(diǎn)熒光猝滅免疫層析法，同時(shí)測(cè)定雞肉中的SAs和FQs殘留。將量子點(diǎn)偶聯(lián)OVA，與包被原混合后包被在硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜上作為T線，量子點(diǎn)受到激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)，未被待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的金標(biāo)抗體層析至T線后，與抗原結(jié)合，由于量子點(diǎn)和膠體金之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，膠體金吸收了量子點(diǎn)發(fā)出的熒光，達(dá)到熒光猝滅的效果。該方法采用“點(diǎn)亮”模式，待測(cè)物的濃度和熒光強(qiáng)度呈正比，相較于“熄滅”模式，提高了方法的靈敏度。在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中，磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline, SQX)的視覺LOD為3 μg/L；在雞肉中，SQX的視覺LOD為30 μg/kg。反應(yīng)時(shí)間在10 min內(nèi)，方便快速，可操作性強(qiáng)。

JIANG等[32]使用脂質(zhì)體包被量子點(diǎn)標(biāo)記抗原，在瓊脂糖凝膠層中進(jìn)行免疫親和層析?？稍诙虝r(shí)間內(nèi)對(duì)牛奶中的SAs和喹諾酮類藥物(quinolones, QNs)進(jìn)行定性和定量。SAs的定性檢測(cè)限為1 ng/mL，再使用數(shù)碼相機(jī)拍攝顯色照片，通過軟件將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相對(duì)光密度值，可定量待測(cè)物含量，同時(shí)降低檢測(cè)限至0.13 μg/L。在牛奶中添加回收率為89%～96%，CV低于11.7%。該方法靈敏度高，但定量方式繁瑣，個(gè)體操作差異性大，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

3.2.3 時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)

時(shí)間分辨熒光免疫分析采用鑭系稀土元素如銪(Eu3+)螯合物標(biāo)記抗原或抗體，螯合物經(jīng)激發(fā)后可發(fā)射特征性的熒光，通過時(shí)間延遲和波長(zhǎng)分辨進(jìn)行檢測(cè)，使強(qiáng)特異性熒光和背景干擾熒光區(qū)分開，有效地排除了干擾問題，提高了分析方法的靈敏度。LE等[33]使用鑭系螯合物Eu3+和Sm3+分別標(biāo)記兩種特異性抗體，建立了雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析法測(cè)定雞肉和雞蛋中的SM2和SQX。該方法檢測(cè)限分別為0.02(SM2)、0.04(SQX) μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范圍為0.01～100 μg/L，且相關(guān)性良好。真實(shí)樣本添加回收率為74.1～107.6%，CV小于12%。鑭系元素螯合物具有激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，Stokes位移大，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)態(tài)測(cè)定范圍寬，試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

3.2.4 上轉(zhuǎn)換納米粒子熒光免疫分析(upconversion nanoparticles fluoroimmunoassay, UNFIA)

上轉(zhuǎn)換納米粒子是一種在近紅外光激發(fā)下能發(fā)出可見光的發(fā)光材料，它能利用長(zhǎng)波長(zhǎng)(較低能量)光子激發(fā)得到短波長(zhǎng)(較高能量)光子的現(xiàn)象，其實(shí)質(zhì)是反Stokes發(fā)光。HU等[34]將 NaYF 4: Yb/Tm 上轉(zhuǎn)換納米粒子標(biāo)記抗體結(jié)合物作為熒光信號(hào)探針，單分散磁性聚苯乙烯微球標(biāo)記抗原結(jié)合物作為免疫信號(hào)捕獲探針，用于測(cè)定動(dòng)物性食品中的SQX。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中SQX的LOD為0.1 μg/L，樣本中為0.5 μg/L。標(biāo)曲線性范圍為0.1～100 μg/L。樣本中添加回收率為69.8%～133%，變異為0.24%～25.06%。該方法前處理簡(jiǎn)單，特別是對(duì)于牛奶樣本，不需要有機(jī)試劑提取，直接稀釋即可進(jìn)行測(cè)定，極大地方便了現(xiàn)場(chǎng)、大批量檢測(cè)。

3.2.5 近紅外熒光染料免疫分析(near-infrared fluoroimmunoassay, NIFIA)

與普通多條帶側(cè)流免疫層析類似，CHEN等[35]使用近紅外熒光染料標(biāo)記抗體，同時(shí)測(cè)定牛奶中的四類抗微生物藥物殘留，分別為β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類藥物?；前奉愃幬锏亩ㄐ韵€值為8 μg/mL，定量線性范圍為0.1～3.98 μg/mL，添加回收93.7%～108.2%，CV低于16.3%，比較可靠。

3.3 化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)(chemiluminescence immunoassay, CLIA)

化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)是將化學(xué)發(fā)光和免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記抗體或抗原，反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物后，在催化劑或氧化劑作用下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過儀器檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度可對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。TAO等[36]建立了雙標(biāo)記時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光免疫分析法。雙標(biāo)記分別為堿性磷酸酶標(biāo)記和辣根過氧化物酶標(biāo)記，利用兩種酶的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動(dòng)力學(xué)差異，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定結(jié)合物的吸光度，可同時(shí)測(cè)定牛奶中的氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類和氯霉素藥物。該方法在一個(gè)微孔中整合了四種抗體，分別為堿性磷酸酶標(biāo)記單鏈抗體、重組青霉素結(jié)合蛋白、單克隆抗體和多克隆抗體，達(dá)到了高通量檢測(cè)小分子污染物的目的。其中磺胺類藥物檢測(cè)限為0.089(磺胺二甲氧嘧啶)～2.7 μg/L(磺胺嘧啶)。

MA等[37]在量子點(diǎn)表面連接磺胺類半抗原，將其半抗原功能化，通過化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析法，在競(jìng)爭(zhēng)模型下，測(cè)定了牛奶中的SM2，檢測(cè)限為9 pg/mL，分析范圍為0.01～50 μg/mL，回收為64.7%～110.7%，CV小于10.6%，反應(yīng)時(shí)間為10 min內(nèi)。這是一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏、可靠的化學(xué)污染物檢測(cè)方法。

3.4 膠體金免疫層析(colloidal gold immunochromatography, CGIC)

膠體金免疫層析法是以膠體金標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)，使用金納米顆粒標(biāo)記抗體作為示蹤物，結(jié)合抗原抗體的免疫反應(yīng)檢測(cè)樣本中的痕量待測(cè)物。HAN等[38]使用膠體金作為抗體標(biāo)記物，建立了多條帶免疫層析法，通過比色，在10 min后快速半定量羊體液(血液、尿液、羊奶)中的β-激動(dòng)劑、磺胺類藥物、四環(huán)素類藥物。其中磺胺嘧啶的比色閾值為3～4 μg/mL，加標(biāo)樣品的添加回收為78.4%～112.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于11.2%，且試紙條測(cè)試結(jié)果與儀器確證結(jié)果一致。該方法前處理簡(jiǎn)單，使用方便，快速可靠且成本較低。

WANG等[39]分別使用膠體金和多色乳膠微球作為抗體標(biāo)記物，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合模型，可同時(shí)檢測(cè)牛奶中的12種磺胺類藥物、18種喹諾酮類藥物和6種四環(huán)素類藥物。膠體金免疫層析法中，磺胺類藥物L(fēng)OD為0.12 μg/mL，IC50為0.42 μg/mL，檢測(cè)范圍為0.19～0.92 μg/mL。該方法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，抗體消耗量小，便于攜帶，方便現(xiàn)場(chǎng)、高通量檢測(cè)。

CHEN等[40]通過雜交瘤技術(shù)，制備了可識(shí)別26種磺胺類藥物的族特異性單克隆抗體，其IC50最低可達(dá)0.08 μg/mL，將該抗體與金納米粒子偶聯(lián)，建立膠體金免疫層析法定性檢測(cè)蜂蜜中磺胺類藥物，視覺LOD為0.25 μg/kg。

膠體金免疫層析法操作方便，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，成本較低，靈敏度較高，檢測(cè)時(shí)間較短，一般在5～10 min，適合高通量快速檢測(cè)。且以上方法初步實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)，但線性范圍較窄，體系不夠穩(wěn)定。

3.5 生物傳感器(biosensor)

生物傳感器是利用酶、免疫制劑、組織、細(xì)胞器或全細(xì)胞等生物識(shí)別元件的特異性生化反應(yīng)，借助電、熱、光等信號(hào)對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的一類裝置。HAO等[41]建立了基于微流控光學(xué)的生物傳感器，用于準(zhǔn)確定量乳制品中的SM2。該生物傳感器結(jié)合了隱失波免疫傳感器和微流控技術(shù)，同時(shí)，在多模光纖探針上連接了SM2-BSA抗原，在抗體表面標(biāo)記了Cy 5.5熒光染料，基于間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析模式，超靈敏、準(zhǔn)確地測(cè)定牛奶及其他乳制品中的SM2，檢測(cè)限達(dá)0.05 μg/L，線性范圍為0.17～10.73 μg/L，牛奶和其他乳制品中的添加回收率為97%～116%，檢測(cè)時(shí)間在15 min以內(nèi)。探針洗滌后可重復(fù)使用300次以上。

LIU等[42]將SM2-BSA抗原固定在光學(xué)傳感器芯片上，和待測(cè)物SM2進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，在隱失波的激發(fā)下，結(jié)合在傳感器芯片上的標(biāo)記抗體發(fā)出熒光，后經(jīng)鎖定放大器被光電檢測(cè)器檢測(cè)，其熒光強(qiáng)度可確定乳制品中的SM2含量。在優(yōu)化條件下，其檢測(cè)限可達(dá)0.06 μg/L，線性范圍0.19～10.10 μg/L，添加回收率80%～107%。

與傳統(tǒng)方法相比，生物傳感器的高度集成化和微型化使其具有響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)便、便于攜帶以及可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)靈敏度高，選擇性好。它作為一種多學(xué)科交叉的新技術(shù)，正在食品安全檢測(cè)中發(fā)展為一種強(qiáng)有力的分析工具。

4 展望

獸藥濫用現(xiàn)象的普遍存在，使得人們對(duì)食品安全憂心忡忡，國(guó)內(nèi)外對(duì)獸藥殘留的監(jiān)管力度也逐漸加強(qiáng)。免疫分析方法作為一種方便快速、高效靈敏且低成本的分析方法得到飛速發(fā)展，商業(yè)化ELISA試劑盒、膠體金試紙條應(yīng)用廣泛。SAs殘留檢測(cè)的向簡(jiǎn)化操作步驟，縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)提高檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度，并實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)方向發(fā)展。

在實(shí)際應(yīng)用中抗體依然是最有效的識(shí)別材料，目前制備出的SAs廣譜特異性抗體可識(shí)別20～30種磺胺藥物。同時(shí)，新型抗體如基因工程抗體、核酸適配體、分子印記聚合物和受體等逐漸應(yīng)用于SAs檢測(cè)，具有穩(wěn)定性高、親和力高、易于體外進(jìn)化、保存方便等優(yōu)勢(shì)。其中，單域抗體(納米抗體)和受體蛋白是重要的發(fā)展方向。此外，熒光微球、量子點(diǎn)、鑭系元素、上轉(zhuǎn)換納米粒子等新型熒光探針用于抗原或抗體標(biāo)記，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和線性范圍。側(cè)流免疫層析和生物傳感器都有能在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確定量藥物殘留的潛力，且可操作性強(qiáng)、高效便攜，在SAs多殘留檢測(cè)中有很好的應(yīng)用前景。

相信在材料、免疫分析模式的不斷優(yōu)化革新下，動(dòng)物性食品中SAs殘留快速檢測(cè)將得到高速發(fā)展。