伍仙　何樹光　劉靈芝

[摘要] 目的 分析梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）Hsp40蛋白的生物學特性并克隆其基因。 方法 通過GenBank查到Hsp40蛋白的序列，利用生物信息學軟件分析其生物學特性。根據(jù)Tp Hsp40基因序列設計特異性引物，利用PCR擴增Hsp40基因，并把該DNA片段連接到pMD19-T載體，轉化大腸桿菌后挑取陽性克隆采用PCR和DNA測序進行驗證。 結果 Tp Hsp40基因能夠編碼374個氨基酸的蛋白質，其分子量為40.1 kDa，無信號肽，呈親水性。Swissmodel 預測得到Tp Hsp40的三級結構與嗜熱桿菌（Thermus thermophilus）Hsp40結構最接近。從Tp基因組中擴增得到1125 bp的Tp Hsp40基因并將其連接到pMD19-T載體。 結論 本文預測了梅毒螺旋體毒力因子Hsp40蛋白的結構和克隆得到Tp Hsp40基因。

[關鍵詞] 梅毒螺旋體；Hsp40蛋白；生物信息學；基因克隆

[中圖分類號] R377 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）20-0041-03

Bioinformatical analysis and gene clone of treponema pallidum Hsp40

WU Xian HE Shuguang LIU Lingzhi CHEN Chaoying ZHU Yixi MO Zuoqun

Clinical Laboratory， First Affiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College， Zhuzhou 412000， China

[Abstract] Objective To investigate the biological characteristics of treponema pallidum （Tp） Hsp 40 and clone its gene. Methods Protein sequence of Hsp40 was found using GenBank and its biological characteristics were analyzed using bioinformatical software. Specific primer was designed based on the genetic sequence of Tp Hsp40 and PCR was used to amplify the gene of Hsp40. The DNA fragment was ligated to pMD19-T carrier and transformed to Escherichia coli. Positive clones were selected to be verified using PCR and DNA sequencing. Results Gene of Tp Hsp40 could encode a protein of 374 amino acids. The molecular weight of the protein was 40.1 kDa. The protein had no signal peptide and was hydrophilic. The tertiary structure of Tp Hsp40 predicted by Swissmodel was closest to the structure of thermus thermophilus Hsp40. Gene of Tp Hsp40 with 1125bp amplified from genome of Tp was ligated to pMD19-T carrier. Conclusion This paper predicted the structure of Hsp40， the virulence factor of Tp， and cloned the gene of Tp Hsp40.

[Key words] Treponema pallidum； Hsp40； Bioinformatics； Gene clone

梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）是引起梅毒的病原體。研究發(fā)現(xiàn)Tp能夠感染并破壞成人多種器官，能經(jīng)胎盤傳入胎兒導致先天梅毒，嚴重者會產(chǎn)生死胎和流產(chǎn)[1，2]。目前我國梅毒患者數(shù)量呈增加趨勢，僅次于病毒性肝炎和肺結核，在法定甲乙類傳染病中排第三位[3-4]。如何有效預防及控制梅毒已成為一個嚴重的社會問題。在Tp中未發(fā)現(xiàn)內毒素等傳統(tǒng)的毒力蛋白，但是通過基因工程獲得Tp鞭毛蛋白、鐵蛋白TpF1、外膜蛋白和趨化蛋白在體外能夠誘導細胞產(chǎn)生炎癥反應，提示這些蛋白可能是Tp致病中的關鍵蛋白[5-9]。尋找Tp新的毒力蛋白是研究其致病機制的關鍵[9]。熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是一組具有保守結構域的蛋白超家族。在細菌受到應激和脅迫時大量表達，幫助細菌適應環(huán)境。最近發(fā)現(xiàn)Hsp40蛋白在細菌致病過程中可能發(fā)揮重要功能[10-13]。我們在Tp的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個Hsp40同源蛋白，本實驗擬采用生物信息學方法分析Hsp40蛋白的生物學特性并克隆得到Hsp40基因，為研究其功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和載體

梅毒螺旋體和大腸埃希菌Top10由湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬第一醫(yī)院檢驗科保存，克隆載體pMD19-T來自寶生物工程（大連）公司。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶，高保真 DNA聚合酶，DNA marker，限制性內切酶NdeI和HindIII和DNA膠回收試劑盒從寶生物工程（大連）公司購買，細菌DNA提取試劑盒和質粒提取試劑盒購自OMEGA公司。

1.3 Hsp40生物信息學分析

從GenBank中獲取梅毒螺旋體（T.pallidum，accession number：NZ_CP003679）的Hsp40基因和蛋白序列。利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化特性，采用ProtScale預測其親水性，采用Swiss-model預測其三級結構。

1.4 Tp Hsp40基因的PCR擴增

依據(jù)Tp Hsp40基因序列，設計PCR引物。Hsp40-F：5-AGCCATATGGTGGCAAAGAAGGATTATTA-3；和Hsp40-R：5-CCCAAGCTTCTACTTGAGACTTG-AAA-3。然后由賽默飛世爾科技公司（廣州）進行合成。以提取的梅毒螺旋體DNA為模板進行PCR擴增Hsp40基因片段。PCR體系：5 μL 10×PCR 緩沖液，1 μL引物 Hsp40-F（10 μM），1 μL引物Hsp40-R （10 μM），0.1 μg模板Tp DNA，1 μL DNA聚合酶（2.5 U/μL），1 μL dNTP Mixture（10 mM），最后加入無菌水到50 μL。PCR反應程序為：94℃ 2 min；（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）×30個循環(huán)；最后72℃ 5 min。得到的DNA片段進行電泳，然后進行回收。

1.5 pMD19-Hsp40質粒的構建與鑒定

將回收的Hsp40片段與pMD19-T載體相連，獲得pMD19-Hsp40重組質粒，然后轉化大腸埃希菌Top10，37℃過夜培養(yǎng)。挑單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后使用PCR鑒定，將陽性菌株進行測序。

1.6 統(tǒng)計學方法

SignalP4.1軟件預測結果表明Hsp40蛋白無信號肽，使用ProtScale軟件預測Hsp40蛋白的親疏水性，使用在線軟件Swissmodel模擬Tp Hsp40蛋白的三級結構。

2 結果

2.1 Tp Hsp40理化特性

利用Protparam分析Hsp40蛋白的理化性質，Hsp40蛋白全長含有374個氨基酸，分子量為40.1 kDa，等電點為8.75。不穩(wěn)定指數(shù)為38.44，表明Hsp40蛋白不容易降解。SignalP4.1軟件預測結果表明Hsp40蛋白無信號肽，定位在細菌細胞質。見封三圖3。

使用ProtScale軟件預測Hsp40蛋白的親疏水性，其中得分負數(shù)的區(qū)域為疏水區(qū)域，得分為正的區(qū)域為親水性區(qū)域，Hsp40的親疏水區(qū)域分散較開，總體呈親水性。見封三圖4。

2.2 Hsp40蛋白的三級結構

使用在線軟件Swissmodel模擬Tp Hsp40蛋白的三級結構，發(fā)現(xiàn)其與嗜熱桿菌（Thermus thermophilus）Hsp40蛋白（PDB：4j80.1）的結構最為接近，獲得結構見封三圖5。

2.3 Hsp40基因的克隆

以Tp DNA為模板PCR擴增Hsp40基因，然后進行電泳，DNA大小約為1150 bp左右（封三圖6A）。將目的片段與pMD19-T相連，轉化大腸桿菌，PCR驗證陽性（封三圖6B）再進行測序，測序結果證明成功克隆到Hsp40基因。

3 討論

梅毒是由Tp感染并嚴重危害人類身心健康的一種性傳播疾病，臨床上可以分為Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期及先天梅毒等。Tp具有極強的侵襲力，進入患者體內后能夠通過血液快速擴散到全身。Tp感染具有極強的隱蔽性，全球梅毒患者數(shù)量極高、傳染性極強，如何有效控制和預防梅毒已成為全球普遍關注的社會和健康問題[2-4]。目前還不能夠在體外培養(yǎng)Tp，只能夠將其接種到兔子睪丸，然后增殖。目前沒有辦法對Tp進行基因敲除，故也無法判斷那些蛋白在梅毒致病過程中發(fā)揮作用。通過體外實驗證實梅毒的外膜蛋白、鐵蛋白、纖連蛋白和鞭毛蛋白等能夠誘導宿主細胞分泌炎癥因子，推測患者感染Tp后，這些蛋白可以誘導宿主產(chǎn)生炎癥反應，并導致宿主損傷[5-8]。尋找新的Tp毒力蛋白是目前Tp研究的熱點問題，闡明這些毒力蛋白的作用機制有助于預防和控制梅毒的傳播。

Hsp蛋白是一組廣泛存在于真核和原核生物中受應激誘導的高度保守蛋白，它又稱為伴侶蛋白。按照分子量的不同，Hsp蛋白可Hsp10，40，60或70等。Hsp40蛋白又稱為DnaJ蛋白，它除了作為分子伴侶外還具有多種功能。特別是近些年發(fā)現(xiàn)Hsp40蛋白在先天性免疫中具有重要作用。研究已證實肺炎鏈球菌Hsp40蛋白可保護小鼠免受肺炎鏈球菌的損害[10-12]。免疫肺炎鏈球菌和傷寒沙門氏桿菌Hsp40蛋白后能夠誘導機體產(chǎn)生免疫性保護功能，減輕肺炎鏈球菌和傷寒沙門氏桿菌的入侵[11-13]。肺炎鏈球菌Hsp40基因缺陷可降低肺炎感染模型小鼠的炎癥反應、促炎因子分泌及胞內信號分子的激活，研究證實Hsp40蛋白能夠通過TLR4受體，活化MAPK、PI3K-Akt和NF-κB等多條途徑，激活DC細胞調節(jié)T細胞參與細胞免疫，接種Hsp40蛋白可以預防肺炎鏈球菌的感染。肺炎鏈球菌Hsp40蛋白能夠活化巨噬細胞，從而誘導免疫應答[12-15]。

此外梅毒感染后的致病周期也較長，并且不同期的梅毒的臨床癥狀也不一樣，采取的治療手段也有區(qū)別，目前所用的診斷方法也不能夠精確判定。分期主要還是依靠患者的臨床癥狀，目前臨床患者數(shù)量多，使得在上報梅毒疫情上存在一定困難[3]，因此急需開發(fā)新的梅毒分期標志?，F(xiàn)在采用基因工程的手段表達了Tp的抗原，這些抗原同樣具有活性，并能用作臨床診斷[16-17]。本文通過生物信息學方法分析了Tp Hsp40蛋白的分子量，親疏水性和三級結構等生物學特性，同時克隆獲得了Tp Hsp40基因。我們預測Tp Hsp40蛋白可能與肺炎鏈球菌等Hsp40蛋白具有類似功能，能夠在促進分泌炎癥因子中起作用，可能是Tp的一個毒力蛋白。目前還沒有特異預防Tp感染的疫苗，為此我們也推測Tp Hsp40分子可能與肺炎鏈球菌、傷寒沙門氏桿菌等的Hsp40分子具有類似的功能，能夠誘導人體對Tp產(chǎn)生免疫應答，從而減少Tp的感染。此外我們還打算進一步分析Hsp40蛋白在梅毒的治療和檢測方面是否具有一定的作用。

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（收稿日期：2018-01-09）