雷杰，段剛峰，鄭瓊莉

(武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

心肌缺血是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)的病理狀態(tài)，冠狀動脈粥樣硬化或痙攣是其主要病因，急性發(fā)作死亡率高。CHD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴重危害著人類健康[1]。中醫(yī)學將冠心病歸屬于“胸痹”等證范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就記載了“心病先心痛”“真心痛，手足青至節(jié)……旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死”。漢代醫(yī)家張仲景詳細論述胸痹的病因病機，首創(chuàng)胸痹的辨證論治，指出“夫脈當取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛”，明確了病機為“陽微陰弦”，即陽氣不通，痰瘀痹阻心脈，并創(chuàng)立了瓜蔞薤白半夏湯、枳實薤白桂枝湯等辛溫通陽的代表方，而薤白、附子、干姜、桂枝則是辛溫通陽的代表中藥。前期研究證實[2-5]，辛溫通陽中藥能降低血清C反應蛋白(CRP)和一氧化氮(NO)水平、減少血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)含量、清除血清超氧化物歧化酶(SOD)、MDA，增加心肌灌注等作用。受仲景思想之啟迪，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學對心肌缺血損失的認識，本課題組擬復制急性心肌缺血大鼠模型，探討辛溫通陽中藥對模型大鼠的保護作用及機制，以期為心血管疾病的治療提供新思路。

1 材料

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠(SPF級)70只，體質(zhì)量(200±20)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證編號：HNASLKJ20100977。

1.2 實驗藥物與試劑

2.6%薤白提取物混懸液(批號091101)、1.9%桂枝提取物混懸液(批號091105)、0.9%干姜提取物混懸液(批號091009)、3.2%附子提取物混懸液(批號091103)(什邡市巨邦植物原料有限公司)；1.6%硝酸甘油混懸液(批號905028KL，齊魯制藥有限公司)；無水乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、4%多聚甲醛、二甲苯(武漢宇陽鋒銳生物科技有限公司)；戊巴比妥鈉(批號30037523，上海國藥集團化學試劑有限公司)；0.9% NaCl溶液(批號20130126，山東康寧藥業(yè)有限公司)；T-AOC、GSH-Px、MDA、MPO測試盒，IL-10、IL-6、TNF-α Elisa試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 實驗儀器

ECG-6951D型心電圖機(上海光電子儀器有限公司)；XSP-BM-30AC電腦型生物顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)；16C14型721分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；Tekmar組織勻漿機(美國Teledyne Tekmar公司)；powerlab/8s型八導數(shù)據(jù)分析儀(澳大利亞埃德公司)；MDF-390ATYO超低溫冰箱(日本SANYO公司)；HX200型動物人工呼吸機(成都春盟科技有限公司)。

2 方法

2.1 實驗分組

70只大鼠用隨機數(shù)表分為7組，每組10只：假手術組、模型組、薤白組、附子組、干姜組、桂枝組、硝酸甘油組。

2.2 模型制備

大鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后進行腹腔注射麻醉(3.5%戊巴比妥鈉，35 mg/kg)，仰位固定，將大鼠與數(shù)據(jù)分析記錄儀(powerlab/8s型)連接好，記錄一段正常心電圖后開胸。隨后將大鼠氣管切開插管，連接動物微量呼吸機(10×60 ml/min持續(xù)進氣)，通過開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支，復制急性心肌缺血模型。具體如下：胸部去毛，消毒，沿左胸骨中線切開線形皮膚口約2 cm，于第4肋間開胸，擴胸，去掉心包膜，暴露出心臟，在左冠狀動脈起始下約2 cm(即左心耳根部與肺動脈圓錐交界處)，用細線結(jié)扎(假手術組只置手術線而不結(jié)扎)。心電監(jiān)護見Ⅱ?qū)?lián)提示ST段顯著抬高，證明結(jié)扎成功。

2.3 給藥方法

造模完成后，在大鼠腹部正中線偏左開口，找到十二指腸，結(jié)扎5 min后，用注射器給藥，薤白組、干姜組、附子組、桂枝組按600 mg/kg給藥；硝酸甘油組按80 mg/kg給藥，假手術組和模型組給予相同體積的生理鹽水，給藥體積為2 ml/kg。

2.4 取材

給藥3 h后觀測心電圖，后立即以血管鉗暫時夾閉大鼠胸壁?？焖傩写笫蟾怪鲃用}取血，立即將其中2 ml血注入含有10%EDTA二鈉30 μl和胰肽酶40 μl的試管中，混勻，離心(4℃，3 000 rpm 10 min)，取上清，放置于-70℃冰箱中保存待測。取血完成后立即取下大鼠心臟置于冰生理鹽水里，洗凈心臟組織，剪取左心室心尖組織凍存，用于心肌MPO活性檢測和組織病理切片制作。

2.5 指標檢測

2.5.1 大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段變化

采用心電圖機標準心電圖Ⅱ?qū)?lián)檢測(標準電壓0.1 mv，走紙速度50 mm/s),分別記錄結(jié)扎前10 min與結(jié)扎后3 h心電圖ST段變化，計算ST段抬高的均數(shù)。

2.5.2 大鼠心肌組織病理形態(tài)學觀察

取心尖缺血的心肌組織，將心肌組織標本用4%多聚甲醛固定24 h，先后用70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度脫水，經(jīng)二甲苯透明，再用蠟塊包埋，最終制成石蠟切片(5 μm)，行HE染色，觀察心肌組織形態(tài)學變化。

2.5.3 大鼠血清氧化應激指標的測定

GSH-Px活性測定采用比色法；MDA水平測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；T-AOC活性測定采用鐵還原法。具體操作按試劑盒說明書進行。

2.5.4 大鼠炎癥因子的測定

采用ELISA雙抗體夾心法檢測大鼠血清IL-10、IL-6及TNF-α水平。MPO活性測定方法如下：將心肌組織稱重,按1∶18的重量體積比，加勻漿遞質(zhì)，制成勻漿(5%),然后加入顯色劑、H2O2，水浴后馬上在分光光度計460 nm處測定A值。具體操作步驟參照MPO測試盒說明。MPO以37℃反應體系中H2O2被分解1 μmol為1個活力單位。

MPO(IU/g)=(測定管A值-對照管A值)/11.3×取樣量(g)

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠急性心肌缺血損傷心電圖ST抬高水平的比較

與假手術組比較，模型組ST段上移明顯，提示造模成功；與模型組比較，中藥組與西藥組ST段抬高均顯著低于模型組(P<0.05，P<0.01) ，提示各辛溫通陽中藥能減輕大鼠急性心肌缺血損傷，各藥物組間比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表1。

表1 辛溫通陽中藥對急性心肌缺血大鼠心電圖ST段的影響

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學的比較

HE染色結(jié)果顯示：假手術組心肌組織結(jié)構(gòu)完整，大部分心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，成束排列，心肌細胞整齊，細胞核為橢圓形，位于細胞中央，肌纖維間散在毛細血管；模型組心肌纖維排列紊亂，心肌纖維斷裂、腫脹，可見小灶性肌纖維壞死，肌纖維間毛細血管擴張充血伴炎性細胞浸潤；薤白組心肌纖維部分斷裂，肌纖維間毛細血管輕度擴張，偶見炎性細胞浸潤；干姜組心肌纖維排列較為整齊，少數(shù)肌纖維斷裂，可見心肌細胞壞死并伴有中性粒細胞浸潤及毛細血管擴張充血；附子組、桂枝組心肌纖維排列較為整齊，少數(shù)心肌纖維斷裂，僅見一部分心肌腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，肌纖維間毛細血管擴張充血不明顯；硝酸甘油組肌纖維排列整齊，極少數(shù)肌纖維斷裂，肌纖維間少數(shù)毛細血管擴張充血，無明顯炎性細胞浸潤。 結(jié)果見圖1。

3.3 各組大鼠急性心肌缺血損傷氧化應激指標的比較

與假手術組比較，模型組T-AOC、GSH-Px的活性明顯降低 (P<0.01)，而MDA 的水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥組與西藥組均能顯著升高血清T-AOC及GSH-Px 的活性(P<0.05，P<0.01)，明顯降低MDA水平(P<0.05，P<0.01)。組間比較，薤白組較其余各組T-AOC升高更顯著(P<0.05)；干姜組較其它藥物組MDA水平較高(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表2。

圖1 大鼠急性心肌缺血損傷心肌細胞組織病理學觀察(HE染色，200×)

表2 辛溫通陽中藥對大鼠急性心肌缺血血清氧化應激的影響

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 各組大鼠血清炎癥指標的比較

與假手術組比較，模型組血清IL-6、TNF-α水平及MPO活性明顯升高(P<0.01)，血清IL-10顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，辛溫通陽各組均能降低IL-6、TNF-α水平及MPO活性(P<0.05，P<0.01)，相應地增加IL-10的水平而減輕炎癥細胞浸潤程度(P<0.05，P<0.01)；組間比較，薤白組與桂枝組對IL-10升高更加明顯(P<0.05)，二者之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；各藥物組IL-6、TNF-α水平無顯著性差異(P>0.05)；附子組MPO活力較高(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表3、圖2。

表3 辛溫通陽中藥對大鼠急性心肌缺血損傷炎癥反應的影響

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：A.假手術組；B.模型組；C.薤白組；D.附子組；E.干姜組；F.桂枝組；G.硝酸甘油組。圖2 辛溫通陽中藥對大鼠急性心肌缺血損傷炎癥反應的影響

4 討論

冠心病急性心肌缺血是臨床常見病和多發(fā)病，90%的發(fā)病原因是由于冠狀動脈粥樣硬化所引起的，結(jié)果造成心肌處于一種缺血、缺氧的病理狀態(tài)。目前認為其機制主要包括兩個方面：1)氧化應激[6]：氧自由基產(chǎn)生過多，清除能力下降，導致氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，活性氧被大量產(chǎn)生，一方面直接通過氧化還原反應損傷生物膜，另一方面間接地激活中性粒細胞引起細胞內(nèi)Ca2+超載。在氧化應激過程中，GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，可以使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能[7]。而MDA是脂質(zhì)過氧化的一個重要指標，MDA的產(chǎn)生會加劇細胞膜的損傷[8]。T-AOC反映出機體抗氧化能力的水平[9]。2)炎性因子[10]：炎癥可產(chǎn)生大量的NO導致組織損傷，進而引起內(nèi)皮損傷，加速冠脈粥樣硬化的形成。白細胞介素又參與人體免疫反應的調(diào)節(jié)與表達[11]，其中IL-6可促進炎性介質(zhì)直接作用于血管壁，改變其通透性，損害心肌組織；IL-10能夠降低促炎性細胞因子的產(chǎn)生并具有免疫抑制作用；MPO涉及到動脈粥樣硬化的所有階段，可引起內(nèi)皮細胞功能損傷，與冠脈疾病密切相關[12]。TNF-α可損傷血管內(nèi)皮細胞，導致血管損傷和血栓形成[13]。

中醫(yī)學中無急性心肌缺血的概念，據(jù)其臨床癥狀多歸屬于“心痛”“胸痹”“真心痛”等范疇?！靶乇浴辈∶滓娪凇饵S帝內(nèi)經(jīng)》，至漢代張仲景加以豐富，明確了胸痹乃上焦陽氣不足，下焦陰寒氣盛的本虛標實之證，并確立了辛溫通陽的治療大法。中醫(yī)學理論中對陽氣較為重視，《素問·生氣通天論》載：“陽氣者，若天與日，失其所，則折壽而不彰”[14]。人之陽氣就如同日光，太陽主宰自然界生物的生長發(fā)育，人之陽氣則主宰著我們機體生命活動的全過程。陽氣同時又以“通”為用，葉天士言:“陽氣窒閉，濁陰凝痞”，具體來講即是陽氣不通，從而導致濁陰凝聚，痞塞壅滯[15]?！靶臑榛鹋K，燭照萬物”，心以陽氣用事，陽氣不通，痰瘀痹阻則導致心肌缺血，針對此證，葉氏提出“通陽必以辛熱”[16]。薤白、附子、干姜、桂枝作為辛溫通陽中藥的代表，在心血管疾病的防治中發(fā)揮了重要作用?！侗静輬D經(jīng)》記載：“薤，味辛則散， 散則使在上寒滯消……瘀血可散，胸痹刺痛可愈。”《本草新編》言：“細辛陽藥也……善降濁氣而升清氣?！?而桂枝又具辛溫之性，能溫通經(jīng)脈、通陽化氣；干姜“通心助陽”“去臟腑沉寒痼冷”，善發(fā)諸經(jīng)之寒氣[17]?，F(xiàn)代藥理學研究也發(fā)現(xiàn)，薤白對心肌損傷具有保護作用，能夠擴張血管、 抑制凝血和抗血栓[18]。桂枝所含桂皮醛、桂皮酸鈉具有擴張血管、抗血小板聚集、抗凝血作用[19]。干姜內(nèi)所含姜烯酚等活性物質(zhì)具有興奮心臟，擴張血管，抗血小板聚集等作用[20]。附子煎劑則具有明顯的強心作用，能夠加強心肌收縮力，增加收縮幅度和頻率[21]。

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)心肌缺血后的大鼠從心電圖顯示ST段明顯抬高，與模型組相比，病理形態(tài)HE染色顯示，各辛溫通陽中藥組心肌損傷程度下降，血管擴張和炎性浸潤也相應減少。從氧化應激和炎癥因子角度分析，較模型組而言，各辛溫通陽中藥組能顯著升高血清T-AOC及GSH-Px活力，降低MDA的水平，并能降低IL-6、TNF-α濃度及MPO活力，增加IL-10的水平從而減輕炎癥細胞浸潤程度，說明辛溫通陽中藥對急性心肌缺血大鼠具有保護作用。

綜上所述，薤白、附子、干姜、桂枝這些辛溫通陽中藥能夠起到保護急性心肌缺血大鼠心肌損傷的作用，其機制可能與調(diào)控氧化應激，抑制脂質(zhì)過氧化，降低相關炎性細胞或因子的釋放有關。