陳 剛 ， 周兆海 ， 蔣焱平 ， 梁浩釗 ， 楊 鴻 ， 白銀山 ， 盧玉葵 ， 鄧 樺

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院 ， 廣東佛山528231)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級BALB/c雄性小鼠6～8周齡，體質量(20±2)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2 藥物及主要試劑 將黃芪、白術和防風粉劑按質量比3∶1∶1配成玉屏風散，通過水提取，過濾加熱濃縮，醇提純，最后在低溫下制成粉末狀的精制玉屏風散總多糖，測定其精制多糖含量>90%，分裝后于-20 ℃保存。RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBCO產品，批號8118007)；胎牛血清(BI產品，批號040011A)；刀豆蛋白A(ConA,Sigma產品,批號SLBS3295V)；細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號201711)；抗小鼠CD3e-Percp、CD4-FITC、CD8a-PE、CD19-PE(BD-Pharmingen產品，批號分別為5079796、6032902、2303659、0000080204)。

1.1.3 主要儀器 全自動酶標儀(廣州市昊洋貿易有限公司)；BD FACSVerse流式細胞儀(BD公司)；超凈工作臺(上海智誠分析儀器制造有限公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)；CO2培養(yǎng)箱(Forma Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠小腸PPs淋巴細胞的制備 小鼠脫頸椎處死，75%酒精浸泡3 min，無菌取出小腸PPs，PBS清洗，研磨過濾，獲得單細胞懸液，離心棄上清，洗滌3次，重懸細胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2.2 配制不同濃度YPF-P 稱取YPF-P，PBS溶解完全，0.22 μm濾膜過濾，倍比稀釋，制成相應濃度的YPF-P溶液，現配現用。

1.2.3 YPF-P細胞試驗 細胞計數并調整細胞密度至3×106個/mL，以每孔180 μL細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，孵育1 h后，加入5種不同濃度的YPF-P溶液(終濃度分別為8、4、2、1、0.5 mg/mL)，每孔20 μL,對照孔加PBS，均設6個復孔，培養(yǎng)4 h，進行MTT試驗，全自動酶標儀比色(波長630 nm)，檢測OD值，初步得出YPF-P對PPs淋巴細胞體外活性增強的有效濃度。

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1.2.5 YPF-P不同作用時間小鼠PPs淋巴細胞體外活性的測定 操作同1.2.3，細胞孵育1 h后，分別于0 h、12 h、20 h、24 h、28 h、36 h時加入相同濃度C1的YPF-P溶液，每孔20 μL，ConA 10 μL。設細胞對照組,均設6個復孔，之后置于培養(yǎng)箱中分別作用36 h、24 h、16 h、12 h、8 h、0 h。MTT試驗，檢測OD值，分析得出YPF-P有效濃度C1發(fā)揮最佳作用的時間點，用于后續(xù)試驗。

1.2.6 PPs淋巴細胞體外培養(yǎng)體系中細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ含量測定 按1.2.1方法制備淋巴細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板，分為對照組,ConA刺激組,YPF-P協同 ConA組(各組每孔分別加不同濃度的YPF-P 20 μL，ConA 10 μL,YPF-P終濃度分別為 1、2、4 mg/mL,ConA終濃度為 2.5 μg/mL)，每組6個復孔。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集上清液，按照 ELISA試劑盒說明書方法操作，在酶標儀波長450 nm處，測定OD值，繪制標準曲線，計算出相應測試樣品中的IL-2、IL-4、IFN-γ含量。

1.2.7 PPs淋巴細胞表型的測定 按1.2.1方法制備淋巴細胞懸液，接種于12孔板中的4個孔，每孔1.8 mL，其中3孔分別加入1、2 mg/mL和4 mg/mL的YPF-P溶液0.2 mL和ConA 0.1 mL，另外1孔加入等量PBS作為對照，于培養(yǎng)箱中孵育。24 h后收集懸液于離心管，離心棄上清，冷PBS洗滌2次，調整細胞濃度為1×107個/mL。取100 μL于一套流式管中進行熒光標記，依次加入抗小鼠CD3e-Percp 5 μL、CD4-FITC 2 μL、CD8a-PE 2.5 μL、CD19-PE 5 μL，各管混勻后室溫避光孵育30 min,冷PBS洗滌2次，棄上清，200 μL的PBS重懸細胞后進行流式細胞儀檢測。

1.2.8 統(tǒng)計學處理 試驗所得數據用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件處理，多組間采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法。采用統(tǒng)計學軟件Origin8.5進行作圖。

2 結果

2.1 不同劑量YPF-P對小鼠PPs淋巴細胞活性的影響 由圖1可見，YPF-P可增強PPs淋巴細胞的活性。與對照組相比，除0.5 mg/mL YPF-P劑量組未見顯著差異外，其余各劑量組均出現極顯著差異(P<0.01)。各劑量組之間比較，以2 mg/mL和4 mg/mL劑量組細胞活性最高(P<0.01)，當劑量達到8 mg/mL時，與1 mg/mL劑量組無顯著差異，但明顯高于0.5 mg/mL劑量組(P<0.01)。

圖1 YPF-P對小鼠PPs淋巴細胞體外活性的影響(n=6)注：所標小寫字母不同者表示差異顯著P <0.05；大寫字母不同者表示差異極顯著P<0.01，下圖同

2.2 YPF-P協同ConA對小鼠PPs淋巴細胞增殖活化的影響

2.2.1 YPF-P協同ConA對PPs淋巴細胞的影響 由圖2可見，YPF-P能協同 ConA增強小鼠PPs淋巴細胞體外活性。與ConA刺激組相比，除0.5 mg/mL和1 mg/mL YPF-P劑量組未見顯著差異外，其余各劑量組均出現極顯著差異(P<0.01)。各劑量組之間比較，以2 mg/mL YPF-P劑量組細胞活性最高，且當劑量達到2 mg/mL時,與0.5 mg/mL和1 mg/mL劑量組相比差異極顯著(P<0.01)，但與4 mg/mL和8 mg/mL YPF-P劑量組無顯著性差異。

圖2 YPF-P協同ConA對小鼠PPs淋巴細胞體外活性的影響 (n=6)

2.2.2 YPF-P協同ConA對小鼠PPs淋巴細胞增殖活化的影響 由圖3可見，不同濃度的YPF-P能協同ConA促進小鼠PPs淋巴細胞體外增殖活化。與ConA刺激組相比，除0.5 mg/mL和1 mg/mL YPF-P劑量組未見顯著差異外，其余各劑量組均出現顯著差異，2 mg/mL YPF-P劑量組差異極顯著(P<0.01)，4 mg/mL和8 mg/mL YPF-P劑量組差異顯著(P<0.05)。各劑量組之間比較，以2 mg/mLYPF-P劑量組細胞增殖活化最明顯，且當劑量達到2 mg/mL時,與0.5 mg/mL和1 mg/mLYPF-P劑量組相比差異顯著(P<0.05)，但與4 mg/mL和8 mg/mLYPF-P劑量組無顯著性差異(P>0.05)。根據上述結果，本論文選用2 mg/mL作為最佳劑量，進行YPF-P協同ConA作用的后續(xù)研究。

2.3 YPF-P不同作用時間對小鼠PPs淋巴細胞活性的影響 由圖4可見，在2 mg/mL的YPF-P單獨作用時，各時間點淋巴細胞活性與0 h相比，均有極顯著差異(P<0.01)，16 h達到最高，并持續(xù)保持高活性至36 h。ConA協同YPF-P作用時，細胞活性在8 h極顯著增強(P<0.01)，在24 h和36 h達到最高，并呈持續(xù)上升趨勢。結果提示，在一定時間范圍內，隨YPF-P作用時間的延長，細胞活性可明顯增強并保持較高活性。

圖3 YPF-P協同ConA對小鼠PPs淋巴細胞體外增殖活化的影響 (n=6)

圖4 不同作用時間YPF-P對小鼠PPs淋巴細胞體外增殖活化的影響 (n=6)

2.4 YPF-P對小鼠PPs淋巴細胞IL-2、IL-4、IFN-γ水平的影響 由表1可見，YPF-P能協同 ConA促進小鼠PPs淋巴細胞分泌 IL-2、IL-4、IFN-γ。ConA 刺激組 IL-2、IL-4、IFN-γ分泌水平均高于對照組，且差異顯著(P<0.05)。1、2、4 mg/m L的YPF-P協同ConA均能促進小鼠PPs淋巴細胞分泌IL-2、IL-4、IFN -γ，其分泌量均高于空白對照組和ConA刺激組，差異極顯著(P<0.01)，并呈一定的量效關系。

表1 YPF-P 對小鼠PPs淋巴細胞IL-2、IL-4、IFN-γ的影響 (n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與ConA刺激組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.5 YPF-P對小鼠PPs淋巴細胞表型的影響 YPF-P作用后，小鼠PPs淋巴細胞CD3+、CD4+細胞比例上升，與對照組相比，2,4 mg/mL劑量組差異顯著(P<0.05或P<0.01)；所有劑量組CD19+細胞、CD4+/CD8+細胞的比值均高于對照組(P<0.05或P<0.01)；2,4 mg/mL組CD19+/CD3+細胞的比值下降(P<0.05)。見表2。

表2 YPF-P 對小鼠PPs淋巴細胞表的影響(%) (n=6)

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

3.1 YPF-P對PPs淋巴細胞體外增殖和活化的影響 ConA是一種有絲分裂原，可促進淋巴細胞增殖活化。T、B淋巴細胞是參與機體免疫應答的主要免疫效應細胞，其體外增殖活化能力在一定程度上可以反應機體的免疫功能[8]，而PPs中含有大量的T、B淋巴細胞，所以，PPs淋巴細胞體外增殖活化反應可作為研究腸黏膜免疫功能的重要手段和指標。本試驗中，YPF-P在單獨作用時，對PPs淋巴細胞表現較明顯的促增殖活化作用；在協同ConA作用PPs淋巴細胞后，能更加明顯促進細胞的增殖活化；當2 mg/mL的YPF-P協同ConA作用時，在0～36 h時間內，隨作用時間延長，細胞活性明顯增強并保持較高活性，且在同一時間比無ConA協同的細胞活性高。

3.2 YPF-P對PPs淋巴細胞分泌細胞因子的影響 根據輔助性T細胞(Th)亞群細胞因子的表達機制和生理功能不同，將其分為Th1和Th2兩類細胞，兩者分泌不同的細胞因子分別介導細胞免疫反應和體液免疫反應[9]。IL-2主要由Th1細胞產生，主要作用是促進T淋巴細胞增殖分化，亦可作用其他免疫細胞，在機體免疫調節(jié)方面發(fā)揮重要作用，其分泌水平可反映細胞免疫功能。 IL-4主要由Th2細胞產生，是Th2細胞最特異分泌的細胞因子，主要作用B淋巴細胞，在免疫應答過程中，主要表現為對細胞免疫的抑制和對體液免疫的促進作用。IFN-γ主要由Th1細胞產生，是Th1細胞最特異分泌的細胞因子，可以增強抗原遞呈細胞與T細胞的作用，能誘發(fā)IL-2受體的表達，促進T細胞增殖，從而進一步擴大免疫應答[10]。細胞因子是免疫調節(jié)的關鍵物質之一，對于腸道黏膜免疫顯示出重要的免疫調節(jié)作用，其分泌水平是判斷機體免疫功能的一個重要指標。本試驗中，YPF-P協同ConA能明顯促進PPs淋巴細胞分泌IL-2、IL-4、IFN-γ，提示YPF-P對腸黏膜免疫應答的作用機制可能與細胞因子的分泌水平及細胞因子之間的相互作用有關，同時表明，YPF-P既能促進細胞免疫又能促進體液免疫。

3.3 YPF-P對PPs淋巴細胞表型的影響 PPs中含有大量的T、B及其他多種免疫細胞，CD3+和CD19+分別是T、B細胞表面特異性標記分子，其含量高低可相應反映細胞免疫反應和體液免疫反應水平。CD3+T淋巴細胞根據其表面抗原不同，分為CD4+和CD8+兩類，CD4+是所有Th淋巴細胞表面的特異性標記分子，可分泌多種細胞因子并促進T、B細胞增殖分化，在機體免疫系統(tǒng)起重要作用；CD8+是所有細胞毒性淋巴細胞(Tc)表面的特異性標志分子，Tc代表具有殺傷靶細胞活性的細胞亞群，可反映機體的細胞毒殺傷作用和抵御、清除病原的能力，通常使用CD4+/CD8+的比值變化代表機體免疫的偏移方向[14]。本試驗中，YPF-P作用后，PPs淋巴細胞中CD3+、CD19+細胞比例上升，說明YPF-P能促進T、B淋巴細胞的增殖分化，既能促進細胞免疫又能促進體液免疫，這與上述結果相符；2,4 mg/mL組CD19+/CD3+細胞的比值下降，且都低于對照組(P<0.05)，但CD19+細胞和CD3+細胞比例上升，說明一定劑量的YPF-P以促進T淋巴細胞的增殖分化為主；CD4+/CD8+細胞的比值均高于對照組(P<0.05或P<0.01)，且CD4+比例上升，CD8+比例較穩(wěn)定，說明Th淋巴細胞大量增殖造成其在T淋巴細胞所占比例相應增多，表明YPF-P可以明顯促進T淋巴細胞增殖，這與CD19+/CD3+細胞的比值變化結果相符，CD4+/CD8+細胞的比值升高，機體細胞免疫增強，這可能與Th淋巴細胞分泌的細胞因子介導的免疫反應及細胞因子之間的相互作用有關。

研究表明，一些中藥多糖對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的功能具有正向調節(jié)作用，可增強機體的免疫功能[11-12]。本試驗結果顯示，YPF-P能促進小鼠小腸PPs內T、B淋巴細胞的增殖活化和免疫調節(jié)作用，提高相關細胞因子的分泌量，明顯增強小鼠腸黏膜免疫功能。