徐耀輝 ， 齊亞如 ， 周俊豪 ， 王明瑜 ， 陳 益 ， 蔣增海 ， 鄧同煒 ， 李文剛

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046)

雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的一種重要的禽類傳染病，可造成幼雛大量死亡、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降、種蛋孵化率降低，弱雛率增加。沙門菌既可經(jīng)飲水、飼料甚至媒介生物水平傳播，也可經(jīng)受精卵垂直傳播[1]。我國對雞沙門菌病非常重視，將其列為16種優(yōu)先防治的動物疫病之一。《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》提出， 2020年全國所有種雞場沙門菌病達到凈化標準。由于至今仍沒有一個理想的疫苗上市，并且嚴格的生物安全措施在相當數(shù)量的養(yǎng)殖場難以實現(xiàn)，為防治包括沙門菌病在內(nèi)的細菌性疾病，抗菌藥物在臨床上仍廣泛應(yīng)用甚至濫用，使得動物源細菌的耐藥性逐漸增強，對養(yǎng)殖場細菌性疾病的防控乃至公共衛(wèi)生受到了嚴重挑戰(zhàn)。目前，關(guān)于河南省雞白痢沙門菌耐藥狀況的報道資料較少。本試驗對2014年7月-2015年8月分離自河南省6個地區(qū)12個雞場的395株雞白痢沙門菌進行耐藥表型及耐藥基因檢測，以了解沙門菌耐藥狀況及耐藥規(guī)律，為進一步了解耐藥產(chǎn)生機制，指導(dǎo)科學(xué)使用藥物、防控雞沙門菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 2×TaqMaster Mix、DNA Marker DL-2 000，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；MH瓊脂及藥敏紙片，購自英國Oxoid公司；麥氏比濁管，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。擴增耐藥基因所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗菌株 標準菌株大腸桿菌ATCC25922由江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室惠贈；395株雞白痢沙門菌均為2014-2015年分離自河南省6個地區(qū)共12個種雞場自帶孵化場的死胚樣品。鄭州地區(qū)6個場(ZZ1、ZZ2、ZZ3、ZZ4、ZZ5、ZZ6)；許昌地區(qū)1個場(XC1)；商丘地區(qū)1個場(SQ1)；平頂山地區(qū)1個場( PDS1)；漯河地區(qū)2個場(LH1、LH2)；信陽地區(qū)1個場(XY1)。分離菌株由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院獸醫(yī)傳染病實驗室保存。

1.3 藥敏紙片 試驗所用20種藥敏片均為英國Oxoid公司產(chǎn)品，詳見表1；ESBLs初篩及確證試驗所用藥敏紙片頭孢他啶(CAZ，30 μg/片)、頭孢他啶/克拉維酸(3∶1) (CAZ/CA，30/10 μg/片)、頭孢噻肟(CTX，30 μg/片)、頭孢噻肟/克拉維酸(3∶1)(CTX/CA，30/10 μg/片)，均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.4 藥敏試驗及ESBLs確證試驗 按照K-B法和美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI)手冊[2]進行抗菌藥物的敏感性試驗和產(chǎn)ESBLs菌的篩選及確證試驗。以E.coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，試驗結(jié)果按照手冊[2]要求進行判讀。

1.5 耐藥基因的PCR檢測 根據(jù)耐藥表型不同，擴增相應(yīng)的37種耐藥基因。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶類(Extended-Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)12種：TEM，SHV，CTX-M-1，CTX-M-2，CTX-M-3，CTX-M-8，CTX-M-9，CTX-M-25，OXA-1，OXA-2，OXA-10，PSE；氨基糖苷類10種：armA，rmtA，rmtB，rmtC，rmtD，rmtE，npmA，aac(3)-IV，aac6'-Ib，aadA1-like；頭孢菌素類6種：MOX，CIT，DHA，ACC，EBC，F(xiàn)OX；磺胺類3種：sul1，sul2，sul3；四環(huán)素類6種：tetA，tetG，tetX，tetB，tetC，tetR。引物設(shè)計及反應(yīng)條件見參考文獻[3]，擴增后隨機選取擴增產(chǎn)物進行測序和序列比較。

2 結(jié)果

2.1 雞白痢沙門菌藥敏試驗結(jié)果 分離株對磺胺異噁唑耐藥率最高(74.18%)，對氨芐西林(50.89%)、四環(huán)素(44.56%)、土霉素(43.05%)3種藥物耐藥率較高，對15種抗菌藥的耐藥率均在7%以下，其中對多粘菌素E、美羅培南、亞胺培南全為敏感。盡管分離菌株對環(huán)丙沙星的耐藥率不高(1.27%)，但有較大比例(88.19%)的菌株表現(xiàn)為中介。詳細結(jié)果見表1。經(jīng)ESBLs初篩和確證試驗，有2株分離菌株產(chǎn)ESBLs。

2.2 雞白痢沙門菌耐藥性的雞場分布 在檢測的12個雞場中，所有雞場均能檢測到耐磺胺異噁唑的菌株，11個雞場檢測到耐四環(huán)素、土霉素的菌株，9個雞場檢測到對氨芐西林耐藥的菌株，8個場檢測到耐磺胺甲噁唑/甲氧芐啶藥的菌株，7個場檢測到耐頭孢唑啉的菌株。出現(xiàn)對環(huán)丙沙星(3個)、頭孢曲松(3個)、呋喃妥因(3個)、氯霉素(1個)、恩諾沙星(1個)耐藥菌株的雞場數(shù)量較少。菌株耐藥率在各個場之間差異較大，比如， ZZ6、XC1、SQ1分離菌株耐氨芐西林嚴重(耐藥率超過90%)，而其他場菌株耐藥率較低或不耐藥。ZZ1、ZZ3、ZZ5、ZZ6場菌株對四環(huán)素、土霉素耐藥嚴重(耐藥率超過65%)；對于磺胺甲噁唑/甲氧芐啶，ZZ1、ZZ3、ZZ5場菌株耐藥率均超過65%，而有8個場分離菌株耐藥率低于10%。

2.3 不同場區(qū)來源的雞白痢沙門菌耐藥譜比較 鄭州地區(qū)6個場來源菌株除了ZZ6場較為復(fù)雜，主要耐藥譜為青霉素類-四環(huán)素類-磺胺類(56.38%)外，其余5個場分離菌株主要耐藥譜均為四環(huán)素類-磺胺類；其余5個地區(qū)的6個雞場分離株主要耐藥譜均為青霉素類-磺胺類，其中SQ1場出現(xiàn)最廣泛耐藥譜，可耐8類14種抗生素。

2.4 雞白痢沙門菌耐藥譜檢測結(jié)果 雞白痢沙門菌3重以上耐藥的有110株，占27.84%，以3重耐藥的青霉素類-四環(huán)素類-磺胺類耐藥譜型比例最高，占19.49%，最高可出現(xiàn)8重耐藥。詳見表2。

表1 藥敏紙片種類與檢測結(jié)果

表2 雞白痢沙門菌多重耐藥譜

2.5 雞白痢沙門菌耐藥基因的檢測結(jié)果 共檢測出12種耐藥基因；2株產(chǎn)ESBLs菌株均檢測到TEM 1種耐藥基因；8株耐氨基糖苷類的菌株檢測到aac(3)-IV、aadA1-like 2種耐藥基因；27株耐頭孢菌素類的菌株檢出MOX、ACC、DHA、CIT四種耐藥基因；294株耐磺胺類菌株檢出sul1、sul2、sul3三種耐藥基因；177株耐四環(huán)素類的菌株共檢出tetA、tetR兩種耐藥基因，tetA為優(yōu)勢耐藥基因；各種耐藥基因的檢出率見圖1。

2.6 雞白痢沙門菌耐藥基因型的檢測結(jié)果 本研究中5類耐藥表型的菌株均可檢出一種或多種相關(guān)耐藥基因，且耐藥表型和基因型的符合率均在83%以上，見表3。

圖112種耐藥基因的檢出情況

表3 雞白痢沙門菌耐藥基因型的分析結(jié)果

3 討論

本試驗對河南省新近分離的395株雞白痢沙門菌進行20種抗菌藥物的耐藥性檢測，結(jié)果表明，分離菌株耐藥率超過40%的有4種，分別是磺胺異噁唑(74.18%)、氨芐西林(50.89%)、四環(huán)素(44.56%)、土霉素(43.05%)，這與鄒明等[4]、王德寧等[5]、孫瑜[6]、劉新靜[7]報道的北京、陜西、哈爾濱、河北等地區(qū)的雞源性沙門菌耐藥情況基本一致。這些人獸共用藥物長期被廣泛用于我國的畜禽養(yǎng)殖中，藥物的選擇壓力使細菌產(chǎn)生了相當高的耐藥性，臨床上應(yīng)減少或暫停使用，避免耐藥基因在人類和動物病原菌間傳播，進而通過食物鏈對公共衛(wèi)生造成威脅。

本試驗的395株雞白痢沙門菌對氨基糖苷類藥物耐藥率(小于3%)明顯低于王德寧[5]和孫瑜[6]的報道，可能是氨基糖苷類藥物在涉及的養(yǎng)殖場使用較少。本試驗所有菌株對獸醫(yī)禁用的美羅培南、亞胺培南、多黏菌素E均不耐藥，對氯霉素(1.01%)、呋喃妥因(1.52%)耐藥率較低，表明加強獸藥管理可以有效減少細菌耐藥性的產(chǎn)生。β內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸)能與產(chǎn)酶菌產(chǎn)生的β內(nèi)酰胺酶發(fā)生不可逆結(jié)合而使其失去水解抗生素的能力，本試驗中，當阿莫西林與酶抑制劑聯(lián)用后，它們的抗菌活性顯著增強，產(chǎn)酶菌耐藥率顯著下降(從對氨芐西林的耐藥率50.89%到對阿莫西林-克拉維酸的耐藥率0.25%)，表明在控制產(chǎn)酶耐藥菌感染方面，β內(nèi)酰胺類與酶抑制劑聯(lián)用可能是一種有效方法。

本試驗中菌株對磺胺異噁唑的耐藥率達到74.18%，而對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶耐藥率為17.97%，表明加入增效劑后可明顯增強抗菌藥物的抑菌效果。菌株對氟喹諾酮類藥耐藥率雖較低，但表現(xiàn)中介的比例較高，尤其是環(huán)丙沙星的中介率高達88.19%，預(yù)示著中介菌株轉(zhuǎn)化為耐藥菌株的風險較大[8]，提示我們生產(chǎn)中要科學(xué)合理使用。

本試驗中，來源于相同地區(qū)的菌株耐藥譜較為相似，部分雞場的主要耐藥表型呈現(xiàn)一致。如鄭州地區(qū)的6個場中有5個場存在一個主要的耐藥表型：耐四環(huán)素類-磺胺類，另外1個場(ZZ6)不同。其他5個地區(qū)的6個場分離菌株耐藥譜主要為耐青霉素類-磺胺類，SQ1場菌株耐青霉素類-四環(huán)素類-磺胺類也有較高比例(32.76%)。不同地區(qū)的菌株可能有相似或相近的耐藥譜[9-10]，不同場區(qū)之間沙門菌的耐藥性可能與用藥習慣緊密相關(guān)。

本試驗中27株耐頭孢類的菌株共檢出MOX(66.67%)、DHA(51.85)、ACC(81.48%)、CIT(0.37%)四種耐藥基因，與匡秀華[11]報道的DHA(14.97%)、CIT(2.14%)檢測結(jié)果不一致；177株耐四環(huán)素類的菌株共檢出tetA (82.49%)、tetR(8.47%)兩種耐藥基因，與戴建華等[12]報道的禽源沙門菌耐藥基因tetA (59.09%)、tetB(50%)、tetC(68.18%)的檢測結(jié)果不一致；294株耐磺胺類菌株共檢出sul1(22.11%)、sul2(68.71%)、sul3(49.66%)三種磺胺類耐藥基因，與薛原等[13]報道的雞源沙門菌耐藥基因sul1(100%)、sul2(68.6%)、sul3(94.3%)的檢測結(jié)果不一致；表明在沙門菌產(chǎn)生耐藥性過程中不同耐藥基因的參與程度存在差異。另外，少部分具有耐藥表型的菌株沒有檢測到本文所列的耐藥基因，表明耐藥機制較為復(fù)雜，有待于進一步研究。