羅 清 , 高加卿

(萬達文化旅游規(guī)劃研究院 ， 北京朝陽100022)

鯊魚在分類學(xué)上屬于軟骨魚綱，板鰓亞綱，側(cè)孔總目。它們的共同特征是骨架由軟骨構(gòu)成，軀體呈流線型，皮膚覆有盾鱗，鰓裂每側(cè)5～7個，牙齒數(shù)層可更換[1]。在國內(nèi)，幾乎所有的公共水族館均引進鯊魚進行展示，養(yǎng)殖品種主要有黑鰭鯊、白鰭鯊、檸檬鯊、沙虎鯊、護士鯊、豹紋鯊、扁鯊、雙髻鯊以及鯨鯊等，但現(xiàn)有的醫(yī)療技術(shù)水平難以滿足鯊魚健康管理的要求，鯊魚一旦患病，飼養(yǎng)管理人員往往感到無能為力。現(xiàn)階段中國水族館行業(yè)正處于發(fā)展的高峰期，目前國內(nèi)開業(yè)及在建的水族館或海洋樂園已接近200家，人工養(yǎng)殖各種鯊魚的數(shù)量大大增加，臨床病例也越來越多，但常常因缺乏檢查手段而影響診治。血常規(guī)檢查在人類及其他許多動物的健康檢查、疾病診治過程中具有不可或缺的價值，但鯊魚的血常規(guī)檢查，目前國內(nèi)尚未見報道，國外相關(guān)文獻資料也非常有限。本文以沙虎鯊(Car-chariastaurus)為例，著重介紹鯊魚血常規(guī)檢查的具體操作方法和外周血細胞形態(tài)，以期為業(yè)內(nèi)相關(guān)人員提供借鑒和參考，使血常規(guī)檢查在鯊魚的健康評估方面發(fā)揮應(yīng)有的價值。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 2條成年雌性沙虎鯊，其中1條編號CT-2，體長2.8 m，體重約160 kg；另一條編號CT-5，體長2.6 m，體重140 kg。這兩條沙虎鯊人工飼養(yǎng)3年以上，試驗前1年內(nèi)活動、進食及排泄等均未見異常。

1.2 儀器及試劑 OLYMPUS CX31生物顯微鏡，TRIAC 420200離心機，改良Neubauer血細胞計數(shù)板，改良Natt-Herrick稀釋液，Wright-Giemsa染液，Eppendorf移液器等。

2 試驗方法

2.1 血液采集 鯊魚采血方法有多種，由于本試驗中的沙虎鯊體型較大，為便于操作，特選擇尾部外側(cè)動脈進行采血。采血時由4名潛水員手持自制的聚乙烯塑料袋下水捕捉沙虎鯊。待沙虎鯊鉆入塑料袋后，立即卷起袋口并將其拖至水池邊，然后掏出鯊魚尾鰭，使尾部露出水面。局部消毒后用5 mL或10 mL的無菌注射器、20 G(0.9 mm)針頭沿尾部側(cè)線垂直進針采血1～2 mL，將血液注入EDTA-K2抗凝管中，混勻后及時送實驗室檢驗。

2.2 白細胞和紅細胞計數(shù) 用移液器取Natt-Herrick稀釋液990 μL放入一次性塑料試管中，再加入10 μL抗凝全血，即稀釋100倍。充分混勻后用移液器吸取細胞懸液，充入改良Neubauer血細胞計數(shù)板的計數(shù)池內(nèi)。靜置2～3 min后置于顯微鏡下用低倍鏡或高倍鏡分別計數(shù)白細胞和紅細胞。白細胞計數(shù)區(qū)為四角的4個大方格，紅細胞計數(shù)區(qū)為中央大方格內(nèi)的四角和正中5個中方格。計數(shù)時對于壓線的細胞應(yīng)采用數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則，以保證計數(shù)域的一致性，使計數(shù)準(zhǔn)確。計數(shù)后通過換算分別得出白細胞、紅細胞總數(shù)[2]。

2.3 紅細胞比容測定 紅細胞比容也稱紅細胞壓積，測定時用毛細管吸取混勻的抗凝全血，將毛細管的一端插入膠泥中，封口，然后把毛細管放在離心機的比容槽上，以12 000 r/min離心5～10 min，最后測量毛細管中壓實紅細胞長度和血液總長度，計算其比值。

2.4 血紅蛋白測定 取20 μL抗凝全血，加入5 mL氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)轉(zhuǎn)化液中，充分混勻，以3 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，以消除細胞核的干擾。以標(biāo)準(zhǔn)液校正血紅蛋白儀，然后將待檢樣品吸入儀器進行測定，直接讀數(shù)即得血紅蛋白量，單位為g/L。

2.5 白細胞分類計數(shù) 取血液1小滴置于載玻片的一端，用蓋玻片推制血涂片，自然干燥后使用Wright-Giemsa染液進行染色。油鏡下分類計數(shù)100個白細胞，得出各種白細胞所占百分率。

3 試驗結(jié)果

3.1 血常規(guī)檢查結(jié)果 兩條沙虎鯊血常規(guī)檢查結(jié)果見表1。

3.2 紅細胞形態(tài) 沙虎鯊?fù)庵苎?jīng)改良Natt-Herrick稀釋液稀釋后紅細胞呈卵圓形，細胞核呈圓形或橢圓形，細胞質(zhì)不著色或染淡紫色，細胞核染紫紅色(見中插彩版圖1)。血涂片經(jīng)Wright-Giemsa染液染色后成熟紅細胞大多呈橢圓形，細胞質(zhì)染淡紅色，細胞核呈圓形，多居中或稍偏于一側(cè)，染深紫紅色(見中插彩版圖2)。另外，在本試驗中可見少量未成熟紅細胞。未成熟紅細胞呈圓形或橢圓形，細胞質(zhì)呈現(xiàn)出不同程度的嗜多色性，染成藍色或藍灰色，在個別未成熟紅細胞的細胞質(zhì)內(nèi)可看到Howell-Jolly體，細胞核大而居中，染深藍紫色。

表1 沙虎鯊血常規(guī)檢查結(jié)果

3.3 白細胞形態(tài) 鯊魚外周血經(jīng)改良Natt-Herrick稀釋液稀釋后粒細胞染黑紫色；單核細胞個體大于其他細胞，染淡紫色；淋巴細胞個體較小，染深紫色，看不到明顯的細胞質(zhì)(見中插彩版圖1)。血涂片經(jīng)Wright-Giemsa染液染色后，白細胞可明顯區(qū)分為嗜中性粒細胞、異嗜性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞6種。各種正常成熟白細胞形態(tài)如下：嗜中性粒細胞呈圓形或稍不規(guī)則，細胞質(zhì)是無色的，內(nèi)含少量嗜中性顆?；蛘邿o明顯顆粒，細胞核多為1～2葉，染深藍紫色；異嗜性粒細胞形狀不規(guī)則，細胞質(zhì)中有染成粉紅色的細桿狀顆粒，細胞核染紫紅色，分1～4葉不等，單個未分葉核形狀多不規(guī)則。嗜酸性粒細胞與異嗜性粒細胞大小相似，細胞質(zhì)中充滿紅色圓形顆粒，細胞破碎后嗜酸性顆粒常分散在細胞核附近，細胞核一般為1～2葉，2葉居多，染藍紫色。嗜堿性粒細胞在鯊魚外周血中很少見[3]，筆者所見嗜堿性粒細胞呈不規(guī)則形，細胞質(zhì)中含有一些大而深染的嗜堿性顆粒，細胞核未分葉。淋巴細胞按個體大小可分2～3種，反映了不同的成熟階段[4]，小淋巴細胞呈圓形，圓形細胞核染成深藍色，細胞質(zhì)很少，通常是在核的外面顯現(xiàn)很窄的邊或鋸齒狀輪廓；大淋巴細胞形狀不完全規(guī)則，細胞質(zhì)相對較多，染淡藍色。單核細胞多呈圓形，也有不規(guī)則形，細胞質(zhì)豐富，染成淡藍色或灰藍色毛玻璃樣，有時可見空泡，細胞核呈不規(guī)則圓形、腎形或馬蹄形等，核染色質(zhì)疏松染紫紅色(見中插彩版圖2)。

3.4 凝血細胞形態(tài) 鯊魚外周血經(jīng)改良Natt-Herrick稀釋液稀釋后可見凝血細胞個體較小，染色較粒細胞淺，染淺紫色。血涂片經(jīng)Wright-Giemsa染液染色后，可見凝血細胞有梭形、橢圓形、圓形等多種形狀，細胞核多為橢圓形或圓形，染紫紅色至深紫色不等，細胞質(zhì)較少，染淡紫色。圓形的凝血細胞與小淋巴細胞相似，只是核染色質(zhì)相對疏松著色稍淡，細胞質(zhì)著色較淺，有時含有少量嗜酸性顆粒(見中插彩版圖2)。

4 討論

為維持較高的血漿滲透壓以適應(yīng)海水環(huán)境，鯊魚血液中含有高濃度的尿素、氧化三甲胺、鈉離子、氯離子等[5-8]。因此，在進行紅細胞和白細胞計數(shù)時，特采用改良Natt-Herrick稀釋液(1 000 mL蒸餾水中加入氯化鈉17.38 g，尿素31.5 g，硫酸鈉2.5 g，磷酸氫二鈉2.91 g，磷酸二氫鉀0.25 g，甲基紫2 B 0.1 g，37%甲醛7.5 mL)[9-10]。根據(jù)健康鯊魚外周血中的紅細胞和白細胞數(shù)量，一般來說用改良Natt-Herrick稀釋液將全血稀釋100倍進行計數(shù)是比較合適的。若遇到紅細胞或白細胞過高的樣本，可增加稀釋倍數(shù)；反之，若紅細胞或白細胞過低可降低稀釋倍數(shù)。

鯊魚外周血細胞與禽類比較接近，紅細胞、白細胞和凝血細胞均含有細胞核，使用血液分析儀通常無法準(zhǔn)確進行血常規(guī)檢查，尤其是紅細胞總數(shù)、白細胞總數(shù)及白細胞分類計數(shù)結(jié)果誤差較大，但血紅蛋白和紅細胞比容檢測結(jié)果具有一定的參考價值，若實驗室無血紅蛋白儀和測定紅細胞比容的離心機時，可嘗試使用血液分析儀測定這兩項指標(biāo)(因受細胞核的影響，使用血液分析儀測定血紅蛋白，結(jié)果通常略偏高)。由于本試驗中的樣本量少，也未檢索到沙虎鯊血液學(xué)相關(guān)文獻資料，文中血常規(guī)檢查結(jié)果僅供參考。

關(guān)于鯊魚白細胞分類計數(shù)，目前在國際上尚沒有統(tǒng)一的命名和分類標(biāo)準(zhǔn)，如Arnold將細胞質(zhì)中含有染成粉紅色細桿狀顆粒的白細胞判定為嗜酸性粒細胞，將凝血細胞與白細胞一起分類計數(shù)[10]。然而，細胞質(zhì)中含有染成粉紅色細桿狀顆粒的白細胞與公認的嗜酸性粒細胞在細胞質(zhì)顆粒和細胞核形狀方面都存在明顯差異，依據(jù)禽類的傳統(tǒng)分類方法，筆者將其歸入異嗜性粒細胞[11]。另外，考慮到檢驗人員的操作習(xí)慣，同時便于臨床醫(yī)師參考，筆者建議在涂片做白細胞分類時，勿將凝血細胞計數(shù)在內(nèi)。值得一提的是，在沙虎鯊?fù)庵馨准毎诸悤r可見少量嗜中性粒細胞，筆者以往在企鵝、海龜?shù)葎游锏陌准毎诸愔猩形匆姷?，而沙虎鯊的異嗜性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞及凝血細胞等在形態(tài)方面與企鵝、海龜較為相似。

國際上有關(guān)鯊魚疾病的報道越來越多，臨床診斷技術(shù)較以往也有了明顯的進步[12]。血常規(guī)檢查是鯊魚臨床疾病診斷中重要的手段之一，血常規(guī)檢查的目的是評價其健康狀況，為疾病的診斷、療效觀察、預(yù)后判斷提供依據(jù)，因此，了解各項指標(biāo)的臨床意義亦很重要。白細胞總數(shù)升高通常與感染及炎癥有關(guān)，白細胞總數(shù)降低伴隨淋巴細胞減少或嗜中性粒細胞升高表明應(yīng)激反應(yīng)或膿毒癥[13-14]。異嗜性粒細胞類似于哺乳動物的嗜中性粒細胞，具有較強的噬菌功能，對機體有重要的保護作用，感染性疾病、應(yīng)激等可導(dǎo)致異嗜性粒細胞增多。嗜酸性粒細胞也可以吞噬細菌和其他外來物質(zhì)，但吞噬能力沒有異嗜性粒細胞強。一般認為嗜酸性粒細胞與胃腸道、皮膚、鰓絲的抗原刺激和寄生蟲感染有關(guān)[15]，但也有人認為鯊魚嗜酸性粒細胞升高與寄生蟲感染無關(guān)[16]。因此，關(guān)于鯊魚的嗜酸性粒細胞功能，尚有待進一步研究。嗜堿性粒細胞在鯊魚外周血中很少見，其功能尚未明確，可能如其他高等脊椎動物一樣，參與過敏反應(yīng)。淋巴細胞具有重要的免疫功能，某些病毒性感染癥可見淋巴細胞數(shù)量上升，各種引起異嗜性粒細胞增多的原因均可導(dǎo)致淋巴細胞相對減少。在更高等的脊椎動物中，單核細胞可分化成巨噬細胞，不僅具有強大的吞噬功能，而且在特異性免疫中也發(fā)揮著重要作用，但在鯊魚血液中，其功能尚不清楚，需進一步深入研究。紅細胞總數(shù)、血紅蛋白量、紅細胞比容以及紅細胞平均值測定主要用于評價鯊魚的貧血類型或脫水，其臨床意義與哺乳動物相似，不再贅述。需要注意的是，不同的鹽度環(huán)境或不同的采血部位，鯊魚的血容量會有所不同，對紅細胞比容測定有一定影響，進而可影響臨床判斷[17-18]。另外，鯊魚的凝血細胞相當(dāng)于哺乳動物的血小板，但是凝血細胞不僅參與血液凝集，而且也具有免疫功能[19]。

本試驗詳細描述了沙虎鯊血常規(guī)檢查的具體操作方法及其外周血中各種血細胞的典型形態(tài)，希望能為相關(guān)臨床醫(yī)療人員提供參考借鑒。即使許多水族館或海洋樂園不具備測定血紅蛋白和紅細胞比容的條件，僅手工進行紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及白細胞分類，也能夠獲得重要的鯊魚健康管理數(shù)據(jù)。因此，有必要推廣鯊魚血常規(guī)檢查技術(shù)，使其作為輔助檢查手段之一，在各種鯊魚的健康檢查和疾病診斷中發(fā)揮應(yīng)有的作用。