時 穎, 李 晴, 郭思呈, 李慶偉*, 李鐵松*

(1.遼寧師范大學 生命科學學院 七鰓鰻研究中心,遼寧 大連 116081; 2.大連市第十二中學,遼寧 大連 116081)

七鰓鰻(Lampetrajaponica)隸屬于圓口綱(Cyclostomata)七鰓鰻目(Petromyzonidae).廣泛分布于寒、溫帶的淡水河近海水域,包括非寄生、淡水寄生及洄游寄生種類[1].七鰓鰻是已知最古老的現(xiàn)存于世的脊椎動物,在三十多億年前就已出現(xiàn),在系統(tǒng)進化過程中幾乎沒有形態(tài)上的變化,故有活化石之稱.七鰓鰻作為聯(lián)系無脊椎動物與脊椎動物之間的重要橋梁,反應(yīng)了無脊椎動物的進化史.同時,作為脊椎動物最直接的祖先,七鰓鰻又是脊椎動物演化發(fā)育生物學研究的重要模式生物[2].

抗增殖蛋白2 (PHB2) 是PHB家族中的一員,是一種結(jié)構(gòu)高度保守,分布廣泛的膜蛋白,同時它也是一種多功能蛋白質(zhì),參與細胞的多種生命活動[3],最初作為與鼠B淋巴細胞的IgM受體相互作用的蛋白而被發(fā)現(xiàn)[4].人PHB2基因位于常染色體 12p13上,其全長 cDNA序列共有900個堿基對,編碼中含299個氨基酸殘基的PHB2蛋白,具有高度的保守性,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有一個保守的PHB結(jié)構(gòu)域[5].PHB 家族包括PHB1和PHB2兩種亞型,人PHB1位于染色體17q21上,長11 kb.PHB1和PHB2蛋白以異源二聚體形式存在,12～16對異源二聚體聚合成直徑約為20～25 nm的花環(huán)柵欄狀的復合體,維持線粒體形態(tài)的穩(wěn)定[6].

七鰓鰻(Lm)-PHB2與人PHB2氨基酸序列一致性較高,在PHB結(jié)構(gòu)域處,兩者的氨基酸序列極為相似,而在N-端和C-端,兩者的氨基酸序列存在顯著的差異.其3′端序列含有豐富的信息量,基因的3′非翻譯區(qū)涉及了基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控過程,主要參與調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性及降解速率、翻譯時間和位點、控制翻譯起始及效率[7-8].PHB2的C-端無規(guī)則卷曲部位具有ERα的作用位點[9],3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)是發(fā)揮抗增殖作用的部位[10].李鐵松等[11]發(fā)現(xiàn)Lm-PHB2 的N-端具有信號肽,這可能是決定Lm-PHB2在細胞中定位遷移的因素.基因的5′UTR序列還參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),但其機制尚不明確.本文作者利用基因表達譜芯片技術(shù)分析Lm-PHB2的過表達對張氏肝(CHL)細胞中基因表達差異的影響,為PHB2作為藥物靶點治療人類疾病提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實驗材料

CHL細胞、pEGFP-N1、pEGFP-N1-PHB2菌株由本實驗室保存.

1.1.2 實驗試劑

Trizol試劑購自GIBCO BRL;磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、胎牛血清、Hyclone1640培養(yǎng)基、胰酶購自大連晨鈺有限公司;Translipid Transfection Reagent Kit購自北京TransGen Biotech公司.基因表達譜芯片由上海伯豪技術(shù)有限公司合成.實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)所用引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成,其序列如表1所示.

表1 實時熒光定量PCR所用引物的序列

1.2 實驗方法

1.2.1 CHL細胞培養(yǎng)

CHL細胞自液氮中復蘇,在37 ℃ 的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),培養(yǎng)基選用含10%(質(zhì)量分數(shù))胎牛血清和1%(質(zhì)量分數(shù))雙抗的1640培養(yǎng)基.每天更換1次培養(yǎng)基.當細胞密度達到90%時,用0.25%(體積分數(shù))的胰酶進行消化傳代,復蘇后的CHL細胞經(jīng)3次傳代后用于實驗研究.

1.2.2 瞬時轉(zhuǎn)染

將CHL細胞接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中,待CHL細胞融合度達到70%～80%時,按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染.取pEGFP-N1和pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒DNA 各8 μg分別溶于500 μL 1640培養(yǎng)基中,另取2個tube管分別加入500 μL 1640培養(yǎng)基和20 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體.待充分溶解后,將稀釋后的脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA混合20 min,然后分別加入培養(yǎng)皿中,轉(zhuǎn)染后放入37 ℃的 CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后利用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率.

1.2.3 RNA提取

圖1 瞬時轉(zhuǎn)染后CHL細胞.(a) pEGFP-N1,明場;(b) pEGFP-N1-Lm-PHB2明場;(c) pEGFP-N1 暗場;(d) pEGFP-N1-Lm-PHB2暗場

瞬時轉(zhuǎn)染后的CHL細胞(圖1)用PBS清洗1次,采用傳統(tǒng)方法提取RNA,經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳后,可清晰見到18S、28S及5S條帶,無蛋白質(zhì)和基因組污染.測得光密度(OD)值A(chǔ)260/A280均在1.8～2.0之間,說明提取的RNA符合實驗要求,按說明書反轉(zhuǎn)成cDNA進行后續(xù)實驗.

1.2.4 實時熒光定量PCR(q-PCR)

使用TaKaRa的SYBR PrimeScript RT-PCR Kit 和AB Life Technologies 7500 PCR儀進行檢測.以glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作為內(nèi)參,PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均按說明書.所有反應(yīng)均重復3次,最終測出各基因的表達水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 Lm-PHB2與其他物種氨基酸序列一致性的比較

從NCBI Protein數(shù)據(jù)庫中選擇了其他10個物種的PHB2與Lm-PHB2一起進行進化分析,各物種與東北七鰓鰻的序列一致性如表2所示.由表2可知,從低等的釀酒酵母到高等動物人的PHB2與Lm-PHB2之間都具有高度的序列一致性,這表明PHB2是一種高度保守的,在遺傳進化中必不可少的蛋白.

表2 其他物種與Lm-PHB2的氨基酸序列一致性比較

2.2 Lm-PHB2與人PHB2的氨基酸序列排布

為了檢測Lm-PHB2與人PHB2氨基酸序列的一致性,使用 Bioedit 7.0 軟件對 Lm-PHB2和人PHB2氨基酸序列進行多重比對,結(jié)果如圖2所示.由圖2可知,二者序列一致性高達80%,且在PHB結(jié)構(gòu)域二者的一致性極高,而N-端和C-端的序列一致性較低.這約20%的序列差異表明二者仍可能有許多功能上的差異,且這種差異是由N-端或C-端導致,因此利用基因表達譜芯片技術(shù)對Lm-PHB2轉(zhuǎn)染后CHL細胞的基因表達差異進行分析.

圖2 Lm-PHB2與人PHB2的氨基酸序列排布

2.3 RNA提取、基因表達譜芯片圖像采集與數(shù)據(jù)分析

對基因芯片雜交陣列中提取出的雜交點的熒光信號強度進行定量分析和標準化處理.結(jié)果表明,按照差異倍數(shù)為3的標準,以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒的CHL細胞為對照,在轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后的CHL細胞中共有270條基因表達差異顯著,其中上調(diào)的基因有141條,下調(diào)的基因有129條.

基因本體(GO)在生物信息學領(lǐng)域中廣泛使用.通過將差異基因做 GO 富集分析,可以把基因按照不同的功能進行歸類,達到對基因進行注釋和分類的目的.采取的統(tǒng)計學方法為Fisher精確檢驗,挑選的標準是落在某個term/pathway上的差異基因數(shù)目不小于4,p<0.05(顯著差異).圖3中,取得的 term/pathway按照enrich factor的值從大小降序排列,取前 30 個結(jié)果.Enrich factor 定義為:某個term中的差異基因數(shù)目與總的差異基因數(shù)目之比除以數(shù)據(jù)庫term中總的基因數(shù)目與數(shù)據(jù)庫中總的基因數(shù)目之比.由圖3可知,與對照組相比,當CHL細胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后有大量的基因表達差異,這些基因涵蓋了分子功能、細胞組分和生物學功能.在分子功能方面,電壓-封閉的鉀離子通道的活性和氧結(jié)合活性相關(guān)基因的表達受影響較為顯著;在細胞組分方面,相關(guān)基因的表達受影響偏小,只有反式高爾基體膜和分泌顆粒膜相關(guān)基因受影響顯著;在關(guān)鍵生物學過程中,相關(guān)基因的表達受影響最為顯著,包括他汀類蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化、Stat3蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的正調(diào)控,肽酪氨酸磷酸化的正調(diào)控,其他有機體的細胞殺傷和細胞因子的產(chǎn)生與免疫反應(yīng)都受到顯著的影響.

KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫,它有助于把基因及表達信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進行研究.KEGG提供了所有可能的代謝途徑,包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝,及有機物的生物降解,其采用的分析方式與GO分析一樣.KEGG結(jié)果顯示,與對照組相比,當CHL細胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后有大量的信號通路受影響,其中5條信號通路中相關(guān)基因的變化極顯著,分別是蛋白消化和吸收信號通路、嘌呤代謝信號通路、細胞因子間受體的相互作用、煙酸和煙酰胺代謝途徑和嗅覺信號傳導通路(圖4).這表明Lm-PHB2在人正常細胞中發(fā)揮重要功能.

圖3 GO富集分析

圖4 KEGG富集分析

2.5 實時熒光定量PCR(q-PCR)驗證

利用實時熒光定量PCR對轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒的CHL細胞中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化進行檢測(CHL細胞轉(zhuǎn)染后如圖5所示).結(jié)果表明,在氧化應(yīng)激信號通路中過氧化氫酶(CAT)和人PHB2表達顯著上調(diào),而谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)表達顯著下調(diào),超氧化物歧化酶(SOD)的表達略微上調(diào);在細胞周期信號通路中細胞周期蛋白25同源蛋白C(CDC25C)表達顯著下調(diào),細胞周期蛋白A2(Cyclin A2)的表達沒有顯著變化;在細胞凋亡信號通路中HAX1(haematopoietic cell specific protein 1-associated protein X-1)的表達量顯著降低.這一結(jié)果與基因表達譜芯片的結(jié)果一致.

圖5 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒與pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后相關(guān)基因的表達差異.以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒為對照組,*p<0.05,**p< 0.01

3 討 論

對課題組前期從東北七鰓鰻中克隆出的PHB2(Lm-PHB2)與10個物種進行了同源序列比較,結(jié)果顯示,PHB2在高等脊椎動物和低等動物中存在高度的保守性.Lm-PHB2與人PHB2基因序列一致性較高,這說明Lm-PHB2已經(jīng)具備高等脊椎動物PHB2的基本結(jié)構(gòu)特征,但二者氨基酸C-端和N-端序列的差異提示Lm-PHB2可能存在人PHB2所不具有的特殊功能,因此,后續(xù)通過基因表達譜芯片進行驗證.

基因表達譜芯片結(jié)果顯示,按照差異倍數(shù)大于3倍的標準,以轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒為對照,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2后CHL細胞中共有270條顯著差異表達基因;KEGG富集分析和GO富集分析結(jié)果顯示,Lm-PHB2對CHL細胞的影響涵蓋信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、抗氧化活性等多種信號通路,這說明Lm-PHB2在CHL細胞中發(fā)揮著重要的作用并且作用極為廣泛,有待于繼續(xù)深入研究.

采用實時熒光定量PCR的方法對CHL細胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2后氧化應(yīng)激、細胞周期和細胞凋亡信號通路中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測.結(jié)果顯示,在氧化應(yīng)激信號通路中,CAT和內(nèi)源性PHB2表達顯著上調(diào),GST表達顯著下調(diào),而SOD的表達有略微上調(diào).SOD和CAT是生物體抗氧化酶系統(tǒng)中2種重要的酶類,可以及時清除活性氧自由基,保護細胞成分的結(jié)構(gòu)和功能[12-13].當在CHL細胞中過表達Lm-PHB2時,CAT與SOD表達上調(diào),二者共同參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng).GST具有消除體內(nèi)過氧化物及解毒的雙重功能,可催化谷胱甘肽GSH與中間代謝物的結(jié)合,成為水溶性化合物排出體外,起到解毒的作用[14].GST基因的表達下調(diào)說明Lm-PHB2在CHL細胞中的過表達對細胞無毒性.CDC25C是控制細胞周期進入M期的關(guān)鍵蛋白之一,通過激活Cyclin B1/CDC2促進細胞從G2期進入M期[15-16],其表達下調(diào)說明Lm-PHB2可能參與了細胞周期調(diào)控.HAX1是抗細胞凋亡蛋白,可以與細胞內(nèi)多種凋亡相關(guān)蛋白如caspase 9,Parl和Omi/HtrA2 等相互作用[17],在調(diào)控凋亡信號通路中發(fā)揮作用,其表達量的顯著下調(diào)說明Lm-PHB2可能參與細胞凋亡調(diào)控,并且Lm-PHB2的異常表達并沒有促使CHL細胞凋亡.以上結(jié)果表明Lm-PHB2可能在抗氧化應(yīng)激耐受性、細胞周期調(diào)控和抑制細胞凋亡中都發(fā)揮重要作用,但其中的機制還需要進一步研究.

4 結(jié) 論

選取了10個物種與本課題組前期克隆得到的東北七鰓鰻PHB2(Lm-PHB2)進行氨基酸序列相似性對比,結(jié)果表明各物種的PHB2氨基酸序列在PHB結(jié)構(gòu)域處高度保守,但在N-端和C-端氨基酸序列保守性較低.利用基因表達譜芯片技術(shù)分析了將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Lm-PHB2瞬時轉(zhuǎn)染入CHL細胞后基因的表達差異,結(jié)果顯示CHL細胞中共有270條顯著差異表達基因,其中顯著上調(diào)基因共141條,顯著下調(diào)基因共129條,涉及細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞增殖、細胞代謝和細胞凋亡等多個方面.通過實時熒光定量PCR對基因表達譜芯片分析結(jié)果進行驗證,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Lm-PHB2質(zhì)粒后CDC25C、氧化應(yīng)激相關(guān)基因(CAT、SOD、GST)和抗細胞凋亡基因(HAX1)均有顯著性差異.