雷曉慶, 吳蘭蘭, 王文娟, 林冬枝,2, 董彥君,2*

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234; 2.上海師范大學(xué) 遺傳研究所,上海 200234)

0 引 言

水稻的栽培歷史悠久,中國(guó)約有一半人口以水稻為主食[1],因此研究如何提高水稻的產(chǎn)量來解決日益嚴(yán)峻的糧食問題非常重要.水稻經(jīng)光合作用進(jìn)行干物質(zhì)積累,葉綠體在很大程度上決定了光合作用的效率[2].葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所,是半自主性細(xì)胞器[3],由葉片分生組織細(xì)胞中的前質(zhì)體在相關(guān)的核、質(zhì)基因共同調(diào)控下生成[4-6].自然或非自然因素都會(huì)導(dǎo)致與葉綠素合成或葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因發(fā)生突變,造成葉綠素合成或降解受阻,葉綠體發(fā)育缺陷,最終引起葉色的變化,甚至導(dǎo)致整個(gè)植株死亡[7].已知水稻的一些白化突變體從發(fā)芽至三葉期均呈白化表型,最終無法光合作用而死亡,相關(guān)的基因也得到了初步的定位.程世超等[8]報(bào)道的水稻白化致死突變體abl4的突變基因位于第4染色體;余慶波等[9]將水稻白化致死突變體alb21的突變基因定位在第3染色體,并發(fā)現(xiàn)其葉綠體中只有一些空泡狀結(jié)構(gòu);朱環(huán)環(huán)等[10]將水稻白化致死突變體abl25,定位于第2染色體;夏久成等[11]將一個(gè)返綠的白化突變基因al12,定位在第8 染色體上;潘江杰等[12]通過對(duì)白化致死突變體ABD研究,將ABD基因定位在第7染色體,發(fā)現(xiàn)一個(gè)關(guān)于類胡蘿卜素相關(guān)基因編碼區(qū)上的G變成了A,氨基酸從野生型P(脯氨酸)突變成了L(亮氨酸),導(dǎo)致突變體表型白化.另外,本實(shí)驗(yàn)室也報(bào)道了4個(gè)水稻白化突變基因asl1,asl2,asl3 和asl4,其中asl1[13]和asl2[14]是核糖體白蛋白編碼基因突變引起,asl3是編碼三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Pentatricopeptide repeat,PPR)蛋白基因突變引起[15],白化致死突變體asl4,定位于第2染色體[16].本研究發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個(gè)水稻苗期白化致死突變體asl6(albinoseedlinglethality6),其表型不受溫度影響;對(duì)其葉色、葉綠素含量、葉綠體超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析,并利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)及InDel 分子標(biāo)記對(duì)該突變基因進(jìn)行了定位,為該基因的分子克隆及其作用機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

突變體asl6從粳稻“嘉花1號(hào)”干種子經(jīng)60Coγ射線輻照后代獲得.“嘉花1號(hào)”干種子經(jīng)過輻照之后,突變體進(jìn)行自交選取苗期分離出白化表型的株系(上一代為雜合單株),隨機(jī)選取生長(zhǎng)正常的單株掛牌,收獲掛牌的單株種子播種,根據(jù)后代分離情況確定上一代的基因型,棄純合野生型單株,保留雜合單株.

1.2 方 法

1.2.1 突變體的表型觀察

為了進(jìn)一步確定突變體asl6的表型,將突變體雜合子及其野生(WT)型“嘉花1號(hào)”的種子在32 ℃條件下催芽3 d后,分別播種在裝有水稻土的塑料盆內(nèi),因?yàn)橛泻芏鄿孛舾械耐蛔凅w被報(bào)道,為排除這種溫度差異,將它們分別放置在25 ℃和32 ℃的光照培養(yǎng)箱(GXZ智能型)內(nèi),模擬水稻生長(zhǎng)的自然條件,每日光照12 h,光照強(qiáng)度為180 μmol·m-2·s-1,適時(shí)觀察幼苗葉色變化,并對(duì)其進(jìn)行拍照.

1.2.2 葉片光合色素含量的測(cè)定

突變體asl6與野生型“嘉花1號(hào)”長(zhǎng)至三葉期時(shí),按張憲政的方法[17]測(cè)定其葉片光合色素含量.具體為取野生型“嘉花1號(hào)”和突變體的三葉期的葉片,剪其第三葉片中間區(qū)域,稱取20 mg,將其剪碎,并放入5 mL的離心管中,加5 mL葉綠素提取液(體積比:V乙醇∶V丙酮∶V水=5∶4∶1)并輕輕搖勻,將其放置在室溫、黑暗的環(huán)境中處理18 h,直到葉片的綠色全部溶解到提取液中.利用METASH-UV5100分光光度計(jì)分別測(cè)定470 nm(葉綠素a最高吸收波長(zhǎng))、645 nm(葉綠素b最高吸收波長(zhǎng))、663 nm(葉綠素類胡蘿卜素最高吸收波長(zhǎng))波長(zhǎng)下的吸光值,重復(fù)3次,取其均值.

1.2.3 葉綠體顯微結(jié)構(gòu)觀察

葉片取樣與上述相同葉片,隨后延葉脈方向剪成面積為1 mm2的小正方形,立即放入2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊二醛固定液(V1∶V2∶V3=1∶4∶5,V1,V2,V3分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛,濃度為0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液和無菌水)中,24 h后換新鮮固定液,4 ℃保存.固定之后,進(jìn)行清洗、再固定、洗滌、脫水與硬化、置換、浸漬、包埋、聚合、修塊、切片、染色等一系列處理,再用透射電鏡(Hitachi765型)進(jìn)行觀察拍照.

1.2.4 遺傳分析和定位群體的構(gòu)建

突變體雜合子與“培矮64S”雜交獲得F1種子,收獲單株種子播種,根據(jù)后代分離情況確定上一代的基因型,只保留雜合基因型,自交獲得能用于遺傳分析F2代群體,選取表現(xiàn)為白化表型的單株用于初定位.

1.2.5 水稻DNA的提取

采用TPS (tris physiological saline) 法[18]以及十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[19],提取親本以及F2代遺傳群體基因組 DNA.

1.2.6 基因定位

本研究中,首先利用本實(shí)驗(yàn)室篩選的“嘉花1號(hào)”和“培矮64S”多態(tài)性DNA分子標(biāo)記,隨機(jī)挑選F2中分離出的22株突變表型白化苗作連鎖分析,確定突變基因在哪條染色體上,然后,進(jìn)一步擴(kuò)大F2群體進(jìn)行基因定位,并應(yīng)用 MAPMAKER/EXP 3.0軟件,構(gòu)建目的基因區(qū)域的遺傳圖譜.在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)通過NCBI公布的粳稻日本晴和秈稻9311基因組序列的InDel位點(diǎn),利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物(表1).經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物用2.5%～3.0% (體積分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外線凝膠成像儀上成像,而對(duì)于多態(tài)性不明顯的引物的 PCR 產(chǎn)物,用8% (體積分?jǐn)?shù))的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè),銀染之后觀察拍照記錄.

表1 用于基因定位的引物序列

1.2.7 葉綠體相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析

分別取野生型“嘉花1號(hào)”和突變體asl6植株的三葉期葉片,提取其RNA,并反轉(zhuǎn)為cDNA(RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購(gòu)自全式金的TransZol Plant和TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix).利用qRT-PCR對(duì)葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關(guān)基因(引物序列如表2所示)進(jìn)行RNA水平的表達(dá)量的分析(SYBR Green Realtime PCR Mix試劑盒購(gòu)自東洋紡公司),實(shí)驗(yàn)操作按照說明書進(jìn)行,用到的儀器為ABI7500.

表2 用于qRT-PCR分析的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型

圖1 野生型“嘉花1號(hào)”和突變體asl6植株生長(zhǎng)各時(shí)期表型變化

在 25 ℃和32 ℃人工氣候箱條件下對(duì)突變體asl6和野生型“嘉花1號(hào)”植株苗期葉色表型進(jìn)行觀察,突變體asl6發(fā)芽后長(zhǎng)出的葉鞘、不完全葉以及第2、3片真葉都為白色,到四葉期突變體逐漸死亡(圖1),這表明該突變體葉色變化不受溫度影響,屬于水稻苗期白化致死突變.

2.2 突變體的光合色素含量變化

測(cè)定了野生型“嘉花1號(hào)”與突變體asl6的葉綠素及類胡蘿卜素含量,與野生型相比,該突變體葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量幾乎為零(圖2).由此可知,光合色素合成和積累受影響會(huì)導(dǎo)致植株苗期呈白化表型.

圖2 野生型“嘉花1號(hào)”和突變體asl6植株三葉期葉片光合色素含量

2.3 突變體葉綠體顯微結(jié)構(gòu)

圖3 (a),(b) 野生型“嘉花1號(hào)”和(c),(d) asl6植株葉綠體顯微結(jié)構(gòu)圖(箭頭標(biāo)記為葉綠體)

通過觀察野生型“嘉花1號(hào)”與突變體asl6的葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):野生型葉綠體內(nèi)部存在完整清晰的類囊體片層結(jié)構(gòu),如圖3(a),3(b)所示;而突變體中觀察不到一個(gè)完整的葉綠體并且含有較多空泡,如圖3(c),3(d)所示.這說明該突變體的葉綠體發(fā)育受到影響,導(dǎo)致沒有正常的葉綠體,從而產(chǎn)生白化表型.

2.4 遺傳分析

2.5 基因定位

選取22株F2代白化苗進(jìn)行連鎖分析,發(fā)現(xiàn)水稻第2染色體上的分子標(biāo)記RM525(圖4)有強(qiáng)烈的偏態(tài)擴(kuò)增,因此,判斷asl6位于第2號(hào)染色體上.然后擴(kuò)大群體至2560株,如圖5(A)所示,將該基因定位在分子標(biāo)記ID30471與ID32344之間,其遺傳距離分別為2.3 cM 和3.2 cM.為了進(jìn)一步定位目標(biāo)基因區(qū)域,定位群體擴(kuò)大至4982株,將突變基因定位在ID31982與MM5712之間,物理距離約為293 kb,如圖5(B)所示.該區(qū)間跨越水稻日本晴基因組AP004159.3與AP004187.3之間的多個(gè)BAC克隆群(http://rice.plantbiology.msu.edu).

圖4 分子標(biāo)記RM525在親本P1、P2及22株具有突變表型F2代單株的DNA分離帶型.P1:嘉花1號(hào);P2:培矮64S

2.6 葉綠體相關(guān)基因的qRT-PCR分析

通過實(shí)時(shí)定量PCR來探究突變體asl6中與葉綠素合成、光合作用以及葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量.結(jié)果顯示:突變體中編碼原葉綠素酸脂氧化還原酶基因PORA等葉綠素合成的相關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào),如圖6(a)所示;psaA、psaB、psbA分別為光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心蛋白A、光系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心蛋白B、光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心蛋白A,這些與光合作用相關(guān)的基因的表達(dá)量明顯下調(diào),如圖6(b)所示.優(yōu)先被nucleus-encoded RNA polymerase (NEP)轉(zhuǎn)錄的plastid-encoded RNA polymerase (PEP)核心亞基a、β、β′基因rpoA、rpoB、rpoC1等與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)量也呈下調(diào)趨勢(shì);而編碼核苷酸還原酶的大、小亞基RNRL、RNRS的表達(dá)量下調(diào)很小(圖7).這一結(jié)果與突變體苗期白化致死現(xiàn)象相吻合,表明asl6基因的突變影響了突變體中的與葉綠素合成、葉綠體發(fā)育以及光合作用相關(guān)的基因的表達(dá),從而導(dǎo)致植株死亡.

圖6 突變體中與葉綠素合成(a)和 光合作用(b)相關(guān)的基因的表達(dá)分析

圖7 突變體中與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)分析

3 討 論

葉綠體為半自主性細(xì)胞器,有120個(gè)基因[20],而這些基因只負(fù)責(zé)葉綠體內(nèi)大約5%的蛋白,因此葉綠體的正常運(yùn)作還需要細(xì)胞核基因的參與.當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)基因發(fā)生突變時(shí),均有可能影響葉綠體的正常發(fā)育.目前,水稻中已經(jīng)有超過70種葉綠素/葉綠體缺陷突變體[21].本研究中通過測(cè)定葉綠素含量發(fā)現(xiàn):突變體asl6的葉綠素含量幾乎為零;透射電鏡觀察不到一個(gè)完整的葉綠體且含有較多空泡;經(jīng)qRT-PCR分析可知突變體中與葉綠素合成、葉綠體發(fā)育、光合作用相關(guān)的基因的表達(dá)量明顯下調(diào).該結(jié)果與突變體幼苗期呈白化致死的現(xiàn)象相符合.而葉綠體發(fā)育早期相關(guān)質(zhì)體分裂基因(FtsZ)和編碼核苷酸還原酶大小亞基(RNRL、RNRS)的表達(dá)量變化不大(圖7),說明ASL6基因可能參與調(diào)控葉綠體后期發(fā)育相關(guān)的基因.

本實(shí)驗(yàn)在基因定位過程中,采用4982個(gè)單株F2分離群體,將該基因定位于第2號(hào)染色體的InDel分子標(biāo)記ID31982與SSR分子標(biāo)記MM5712之間約293 kb的區(qū)域內(nèi).通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),該區(qū)間有33個(gè)有功能編碼蛋白的候選基因,11個(gè)未知功能表達(dá)的蛋白基因.通過水稻網(wǎng)站預(yù)測(cè)(http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/request.ep) 發(fā)現(xiàn)了在葉綠體中高表達(dá),且與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因LOC_Os02g52470、LOC_Os02g52650、LOC_Os02g52744,對(duì)其測(cè)序發(fā)現(xiàn)其與野生型基因組序列沒有差異,這說明上述3個(gè)候選基因可能與突變體asl6白化致死無關(guān).目前,在已鎖定的293 kb目標(biāo)區(qū)間內(nèi),還沒有相關(guān)水稻葉色突變基因被報(bào)道.因此,asl6突變基因可能是一個(gè)新的葉色白化致死突變基因.今后,將在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大定位群體,發(fā)展更多新的分子標(biāo)記,對(duì)該基因進(jìn)行克隆和功能分析,這也將有助于更進(jìn)一步了解水稻葉綠體發(fā)育分子的作用機(jī)理.